狂犬病的诊断方法

杨世银 蔡雨函

一、狂犬病病毒及其概况

狂犬病病毒(RV)属弹状病毒科(Rhabdoviridae) 狂犬病毒属(Lyssavirus) 典型的血清Ⅰ型病毒。狂犬病病毒基因组由11928～11932个核苷酸组成,为单链、不分节段的负链RNA 。基因组从5’端至3’端的排列顺序为N、M1、M2、G 和L 基因,分别编码病毒核蛋白(NP)、衣壳基质蛋白(M1P)、膜基质蛋白(M2P)、糖蛋白(GP)和转录酶大蛋白(LP)。狂犬病病毒具有两种主要抗原: 一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原, 能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性,并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体,中和抗体具有保护作用；另一种为内层的核蛋白抗原,可使体内产生补体结合抗体和沉淀素, 无保护作用。其中N 基因高度保守且高效表达,不仅可用于检测狂犬病毒感染,也可作为分子和抗原性的比较对象而广泛用于狂犬病病毒的分类研究中。

狂犬病病毒对脂溶剂（肥皂水、氯仿、丙酮等）、乙醇、甲醛、碘制剂以及季胺类化合物、酸（pH4 以下），碱（pH10 以上）敏感，容易被杀灭；对日光、紫外线和热敏感，病毒悬液经56℃30 ～60 分钟或100℃2 分钟即失去活力，因此也易被巴氏消毒法消毒；不易被酚或来苏尔溶液杀灭；对干燥、反复冻融有一定抵抗力。在50%甘油中保存的感染脑组织中至少可存活1个月，4℃数周，低温中数月、甚至几年，室温中不稳定。反复冻融可使病毒灭活。狂犬病病毒能抵抗自溶与腐烂，在自溶的脑组织中可以保持活力7 ～10 天，冻干条件下可以长期存活。

狂犬病的特征性症状是饮水时, 患者会出现吞咽肌痉挛, 不能将水咽下, 随后患者口极渴却不敢饮水, 故又名恐水症。人狂犬病通常由患病动物咬伤,导致动物唾液中狂犬病毒侵入人体后感染所致。狂犬病是迄今为止病死率最高的急性传染病, 一旦发病, 病死率几乎100%。

二、狂犬病的诊断方法

（一）狂犬病检测安全要求与采样

任何有关狂犬病的实验室工作都具有高危险性,所有RV 可疑污染的物品都应该按照WHO 的要求在安全的条件下妥善处理。所有进行狂犬病诊断以及进行尸体剖检的工作人员在工作之前,都应进行疫苗免疫接种并确认获得保护。

狂犬病是一种以侵害中枢神经系统为特征的致死性疾病,通常采用脑组织学和病毒学检查来确诊。对于病死的动物和人，脑是病毒学检测的主要样本，可以检测到病毒包涵体。狂犬病患病动物及病人的脑脊液也是重要的检测样本,因为脑脊液含有病毒抗原和循环抗体。病毒可通过脑脊液在中枢神经系统内扩散,已证实在感染后期人和犬脑脊液中含有中和抗体。动物活检取脑不太可行,因此皮肤活检更为实用,是临床阶段人狂犬病有效的早期诊断方法。皮肤活检最好的部位是颈部,有时在其他部位上皮也能检测出病毒。应用免疫荧光技术对皮肤活检具有很高的灵敏性。

（二）临床诊断

潜伏期10 天至2个月，有时更久，伤口接近脑、伤口深、病毒排量多、毒力强则潜伏期短、发病快。临床表现可分为狂躁型和麻痹型两种。精神沉郁，常躲阴暗处，不愿接近人，当受到光、音响刺激或主人抚摸时突然跳起，喜欢吃泥土、石块、木片、布块等异物，喉头麻痹，唾液增多。兴奋期2～4天，狂躁不安，攻击性强，乱咬人。病犬表现恐水，听见水声即呈现癫狂发作。眼球突出，消瘦，瞳孔散大或缩小，下颌麻痹。麻痹期1～2 天。病犬舌脱出口外，下颌下垂，流涎，后驱麻痹，走路摇摆，卧地不起，最后呼吸麻痹而死。麻痹性兴奋期短，病犬头部肌肉麻痹，吞咽困难，流涎，恐水，卧地不起等，一般2～4 天死亡。

（三）病理学诊断

病理剖解：病犬体表有外伤或擦伤，口腔和咽喉粘膜充血、出血和糜烂。胃空虚，有石块、木块等异物。脑软膜肿胀、充血和出血，第四脑室有黄色或粉红色液体。肠道呼吸道急性卡他性炎症。

组织学诊断：主要为非化脓性脑炎和神经炎。大脑海马角、小脑和延脑的神经细胞胞浆内有嗜酸性包涵体（内基氏小体）。其直径3～20μm，呈梭形、圆形或椭圆形。

电镜检测：用病犬延脑、海马角、脊液和唾液研磨成悬液，接种PK 细胞，待细胞病变后，3000r/min 离心30min，吸上清制片，电镜观察可见子弹状或杆状病毒粒子，一端扁平、另一端钝圆。

（四）乳鼠诊断方法

取1～2日龄乳鼠，向其大脑注射经青霉素和链霉素处理过的10%的大脑混悬液，注射部位用1%碘酊消毒后，用针头从额骨处插入针头注射0.2ml 脑混悬液。接种后5～8 天，乳鼠出现狂犬病临床症状：后肢和食管麻痹，8～9 天死亡。尸检所见：肠粘膜充血，膀胱充盈，增大5～8 倍。大脑图片和组织切片可观察到奈格尔氏小体，准确性可达100%。

（五）血清学诊断

1、直接荧光抗体试验(DFA)

感染狂犬病病毒的细胞携带狂犬病病毒抗原,狂犬病病毒抗原可以特异性与异硫酸荧光素(FITC)标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体结合。FITC 在荧光显微镜下显示可见荧光,使抗原抗体的特异性反应在荧光显微镜能直接观察。此法快速、特异又敏感,为目前诊断狂犬病病毒感染的首选方法,已被世界卫生组织(WHO)和我国卫生部推荐。可用于狂犬病患者和感染动物的诊断,其标本可选受伤处的皮肤组织、后颈带毛囊的皮肤组织(皮肤切片)和部分体液(唾液、脑脊液等),而角膜(印片)因取样困难,可靠性低,因此不推荐使用。死后可做脑组织检查,在细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒,分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒的多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例,可将免疫荧光反应分为“+…+”(阳性细胞数< 25%为“+”，25%～50%为“++”，50%～75%为“+++”，>75%为“++++”) ,无特异性荧光为阴性。阳性结果表示有狂犬病病毒感染,有确诊意义。

2、酶联免疫吸附实验(ELISA)

根据抗原抗体特异性结合特点,用抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体包被塑料板,与标本中待检抗原结合,其中待检抗原又与后加入的辣根过氧化物酶标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体特异性结合,通过辣根过氧化物酶与底物作用而发生颜色反应,其显色程度与待检抗原含量呈正相关,检测到狂犬病病毒抗原阳性有诊断意义。此法又被称为快速狂犬病毒酶免疫诊断(RREID),由法国Pasteur 研究所首创并被WHO 推荐用于检测狂犬病病毒抗原。其灵敏度高、特异性强,加之无需昂贵设备,操作简便,因此便于推广使用。余光开等建立了ELISA 检测家 犬唾液中的狂犬病病毒抗原,并研制出检测狂犬病病毒抗原试剂盒,其方法敏感、特异,已应用到犬只测毒推广项目中。

（六）分子生物学诊断

目前检测狂犬病病毒的方法有动物接种、病毒分离和血清学试验等,这些方法有的费时、费力,有的存在非特异性反应和敏感性低等缺点,因此迫切需要一种快速、敏感、特异的方法来解决这一问题。核酸诊断是最近几年发展起来的一种检测方法,具有敏感、特异、快速的优点,有人将其应用于狂犬病病毒的检测,取得了较好的结果。

1.RT-PCR 检测技术

邵西群等建立了狂犬病毒RT-PCR 检测方法，采用RNA 提取试剂盒，从病犬的脑组织、脑脊液或唾液中提取狂犬病病毒及其疑似病毒。以病毒保守性强的核蛋白（N）在Genbank 查找序列，多序列比对后根据保守区段设计了3 条引物，其中FP 引物也作为反转录引物。引物FP 和RP 位于参 考 序 列ACCESSION NC-001542 的57～78bp 和647～668bp，PCR 产物长度约612bp。引物如下：RAB-FP1：5’GTAACACCCCTACAATGGATGC3’；RABFP2：5’CTGGATCCTCTACAATGGATGC3’；RAB-RP：5’TGTACTCCAGTTRGCACACAT3’。

反应条件及循环参数RT 反应：20～25μL 体系，RNA 样 品5μL，FP 引 物1μM，dNTP0.5m M，AMV 酶5～7U，Ribonuclease Inhibitor 20U；RNA和引物的混合物在70℃作用8min，冰浴10min。再加入反应其他组分，42℃反应50min，90℃作用7min，cDNA 可于-20℃保存备用。PCR 反应：30μL 体系，cDNA 3μL，FP、R P 引物终浓度各0.3μM，dNTP0.2mM，TaqTM 聚合酶1U；反应循环参数：预变性94℃2min；94℃35s，54℃30s，72℃40s，35个循环；70℃延伸5min。邵西群等通过凝胶电泳技术检测到扩增的612bp 目标产物，可用于快速检测。

2.基因芯片诊断

根据已发表的狂犬病病毒(RV)的序列，设计合成能扩增高度保守核(N)蛋白片断的一对引物。通过生物素标记PCR 技术，将核(N)蛋白基因片断作为探针点在硝酸素纤维膜上，制作成疾病诊断基因芯片。提取可疑动物核酸作模板进行PCR扩增，将其产物与诊断基因芯片进行特异性逆向点杂交检测。此方法建立的狂犬病诊断基因芯片具有比ELISA 更高的灵敏度和特异性。