禽流感诊断和监测拭子样品的采集、运输和保存

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（1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

禽流感诊断和监测拭子样品的采集、运输和保存

张笑春1，刘 朔2，庄青叶1，黄保续2，陈继明2

（1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150000；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

禽流感拭子样品的采集、运输和保存对禽流感病原学诊断和监测很重要。本文介绍了这方面的国际和国内标准，分析了近年来这方面研究进展，最后总结出较优的禽流感诊断和监测拭子样品采集、运输和保存方法，以期为我国禽流感病原学诊断和监测提供参考。

禽流感；拭子样品；采集；运输；保存

禽流感病毒是一类重要的病原，能够引起家禽大量发病和死亡。有些禽流感病毒还能感染人，引起人发病死亡。例如，2013年中国出现的H7N9型禽流感已经引起300多个人间病例，其中约有1/3为死亡病例。禽流感病毒具有亚型多和变异快的特点，使禽流感防控难度极大。开展禽流感病原学监测，快速和准确地检测禽流感病毒感染，对于禽流感防控工作极为重要。在禽流感病毒检测和监测过程中，采集、运输和保存可能带有禽流感病毒的宿主咽喉拭子、泄殖腔拭子、粪便或环境拭子样品。这些过程会影响实验室检测和监测的灵敏度。近年来，在禽流感拭子样品的采集、运输和保存方面的研究取得了一些进展，现就这些研究进展进行综述，如下：

1 样品采集

1.1 拭子类型

根据拭子材料和制作工艺的不同，目前主要有普通医用棉签、聚酯纤维拭子、聚丙烯纤维拭子、聚乙烯棉签、尼龙（聚酰胺纤维）植绒拭子、聚氨酯泡沫拭子和非植绒涤纶拭子等。植绒（focked）是利用电荷的自然特性产生的一种生产新工艺，其原理是利用电荷同性相斥异性相吸的物理特性，使绒毛带上负电荷，把需要植绒的物体放在零电位或接地条件下，绒毛受到异电位靶物体的吸引，呈垂直状加速飞升到靶物体表面上，由于靶物体涂有胶粘剂，绒毛就被垂直粘在靶物体上。如今对禽流感病毒进行检测和监测，常用的样品采集拭子主要是以脱脂棉为原材料制成的医用棉签。

WHO推荐采集人喉鼻拭子时选用聚酯纤维拭子[1]。我国国家标准（CNICSOP07001）建议采集人呼吸道样品时选用聚丙烯纤维头拭子[2]；我国农业行业标准（NY/T 765-2004）规定采集禽粪便或泄殖腔拭子样品时，可使用棉质、聚乙烯或涤纶材质的灭菌棉签，但所采集样品用于病毒核酸定量检测时则最好选用涤纶材质的灭菌棉签[3]。

Fereidouni SR等[4]曾用尼龙植绒和人造纤维两种类型拭子采集禽流感样品，运用real-time RTPCR方法进行检测，对比发现两种拭子产生相似的Ct值，适用性相同。Spackman E等[5]分别采用尼龙植绒、非植绒涤纶（聚酯纤维）和聚氨酯泡沫等三种类型的拭子，采集鸡禽流感和新城疫样品，并利用病毒分离、real-timeRT-PCR和商业抗原检测分析的方法对其进行比较，结果发现尼龙植绒和聚氨酯泡沫拭子的效果优于非植绒涤纶拭子，能够更好捕捉大量样品并将其释放到采样液中。Killian ML[6]对棉签柄的材质进行分析，发现木柄表面物质会影响病毒活性，抑制病毒核酸分离，影响检测结果，因此建议采集禽流感拭子样品时使用塑料柄聚酯棉签。此外，已经证实医学常用的生物活性物质的稳定剂——海藻糖不适合处理拭子，该物质会使病毒失活，病毒滴度在48h内会降低1000倍[7]。

1.2 采样保存液

采集禽流感拭子样品所用的采样保存液一般由用于培养细胞和细菌的基础缓冲液、平衡盐溶液或蛋白缓冲液及抗生素组成。根据采集样品的不同，采样保存液中使用的抗生素种类及用量可进行相应调整。

WHO推荐配方：小牛浸液肉汤10g 、牛血清白蛋白V 2g、无菌蒸馏水400 mL、硫酸庆大霉素溶液（50 mg/mL）0.8 mL、两性霉素B（250μg/L）3.2mL。该采样保存液适用于收集人的喉、鼻拭子[1]。我国国家标准（CNICSOP07001）推荐配方：①呼吸道样品保存液：Hank’s/MEM液（pH 7.4-7.6）400 mL、庆大霉素（50 mg/mL）0.8 mL、多粘菌素B（250 μg/mL）3.2 mL；②粪便样品保存液：1L MEM 中加入7.5%牛血清白蛋白V、青霉素、链霉素、庆大霉素、多粘菌素B、制霉菌素和氧氟沙星，使终浓度分别达到0.5%、2×106U/L、200 mg/L、250 mg/L、2×106U/L、50μg/mL和60 mg/L[2]。调节pH至7.4，分装2～3 mL/管，-20℃冻存。

OIE和我国农业行业标准（NY/T 765-2004）均建议保存禽咽喉拭子、泄殖腔拭子和粪便拭子样品采用加有抗生素的等渗PBS （0.01 mol/L，pH 7.4）作为采样保存液。配方如下：每1L含NaCL 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCL 0.2g。调pH至7.4，高压灭菌后，于4℃备用。我国农业行业标准建议加入抗生素及浓度：青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、丁胺卡那霉素（1000 IU/mL）、制霉菌素（1000 IU/mL）；除庆大霉素（50 µg/mL）替代丁胺卡那霉素外，OIE建议采样保存液抗生素种类及用量与农业行业标准一致。喉气管和口咽拭子加入上述浓度抗生素的保存液即可，粪便和泄殖腔拭子所需抗生素浓度应提高5倍[3，8]。美国国家兽医实验室（NVSL）采集禽气管和泄殖腔拭子样品时使用不含抗生素的BHI （Brain heart infusion）肉汤作为采样保存液（这些样品既可用于病毒的分离，也可用于细菌的分析），同时也建议使用蛋白缓冲液，如胰蛋白胨或蛋白胨肉汤等，其中蛋白可防止病毒降解，增加病毒稳定性[6]。Spackman E等[5]针对禽流感和新城疫拭子样品，采用病毒分离、real-time RT-PCR和商业抗原检测分析的方法，对BHI和PBS采样保存液进行比较，发现BHI比PBS效果好。考虑到成本等诸多方面问题，国内对活禽进行禽流感拭子样品采集时，普遍使用我国农业行业标准推荐的采样保存液。然而，采集人的咽拭子或肛门拭子时，则多使用国标推荐的采样保存液。

2 样品运输和保存

2.1 运输方式

如何运输采集的拭子样品，相关标准并没有对其进行详细说明。Spackman E等[5]将禽流感和新城疫拭子样品，分别使用湿拭子运输、干拭子运输和运输前将拭子从采样保存液中取出这三种运输方式，用病毒分离、real-time RT-PCR和商业抗原检测分析的方法进行评估，结果表明湿拭子运输比干拭子运输效果好，在运输前是否移除拭子，对病毒的检测没有明显影响。Killian ML[6]认为干拭子运输会降低禽流感病毒的分离率，建议采用湿拭子运输。Roelandt S等人[9]采集北京鸭的口咽和泄殖腔拭子，并采用运输干、湿拭子两种方式，利用RTPCR方法进行病毒检测，结果发现口咽拭子采用湿拭子运输效果较好；泄殖腔拭子则采用干拭子运输效果较好；但两种运输方式对禽的定性检测没有影响。

2.2 温度

温度是影响禽流感拭子样品运输和保存的主要因素。样品运输和保存过程中，能否保持病毒活性，对禽流感检测是非常重要的。

WHO规定：样品进行病毒分离检测时，4℃可以保存2天，超出2天则需置于-70℃保存；干冰冷藏运输时，干冰需密闭包装，以防止挥发出的CO2影响病毒活性[10]。我国国家标准（CNICSOP07001）要求样品短途运输可加冰保冷，长途运输需加干冰。粪便样品检测方式不同，推荐的保存温度也不同，如，进行病毒核酸检测时推荐保存温度为-70℃、-20℃和4℃，7天以内也可室温保存；进行病毒分离实验时，建议-70℃保存，4天以内也可置于4℃保存[2]。我国农业行业标准（NY/T 765-2004）建议样品在4h以内采用冰袋运输，若4～24h内能送至实验室可-30℃冷冻再用保温箱加冰袋运输，〉24h送至实验室，则应在-20℃以下保存运输。若送至实验室，不进行样品处理，应在-70℃或更低温度下保存，避免反复冻融[3]。OIE推荐长期储存样品的最佳温度为-140℃，-80℃或-20℃可以保存样品5～10年[11]。

Dundon WG等[12]将瓶装冻干禽流感抗原和抗血清制剂置于4℃、22℃和37℃保存，并选取第0、3、7、14和21天分别进行HA、HI和琼扩试验。结果表明，冻干的禽流感抗原在4℃和22℃保存21天仍存在血凝活性；用于琼扩试验的抗原和抗体在4℃和37℃保存21天可维持稳定。Fereidouni SR等人[4]证实，禽流感拭子样品在4℃和20℃恒温可保存两周，但温度变化对病毒的影响很大。Killian ML[6]建议不要在0℃保存样品，以尽量避免反复冻融；拭子样品可在4℃保存一周，-20℃或更低温度下可保存几周到数月。

3 结论

目前，禽流感监测方法已经建立，并成功应用于许多国家。但是，针对禽流感拭子样品采集、运输和保存这方面的内容很少，没有足够的文献支持，且采集方法标准不统一，常根据家禽种类、监测目标以及材料的成本而发生变化，而统一的标准采样方法可以使禽流感监测更加准确。本文参考现有标准，结合前人实验结果，认为采集禽流感拭子样品适宜选择塑料柄的尼龙植绒、聚氨酯泡沫、人造纤维拭子，建议使用BHI作为采样保存液，采用湿拭子运输，可用干冰冷藏运输。此外，样品可在4℃保存2天；超出2天置于-20℃可保存一周至数月；-70℃可保存5～10年。且尽量避免反复冻融。

[1] World Health Organization. WHO guidelines for the collection of human specimens for laboratory diagnosis of avian infuenza infection[J]. GENEVA：WHO，2005.

[2] 张烨，薄洪. CNICSOP07001，国家流感中心标准操作规程（修订版）[S] 北京：中国疾病预防控制中心病毒预防控制所，2007.

[3] 中华人民共和国农业部. NY/T 765-2004 高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范[S]. 北京：中国农业出版社，2004-02-17.

[4] Fereidouni S R，Globig A，Starick E，et al. Effect of Swab Matrix，Storage Time，and Temperature on Detection of Avian Infuenza Virus RNA in Swab Samples[J]. Avian diseases，2012，56（4s1）：955-958.

[5] Spackman E，Pedersen J C，McKinley E T，et al. Optimal specimen collection and transport methods for the detection of avian infuenza virus and Newcastle disease virus[J]. BMC veterinary research，2013，9（1）：35.

[6] Mary Lea Killian BS M S. Avian influenza virus sample types，collection，and handling[M] Avian Influenza Virus. Humana Press，2008.

[7] Johnson F B. Transport of viral specimens[J]. Clinical microbiology reviews，1990，3（2）：120-131.

[8] Manual O I E T. Chapter 2.3. 4.—Avian infuenza[J]. 2009.

[9] Roelandt S，Outtrim L，Browning C，et al. Evaluation of two different swab transport systems in the detection of avian influenza virus excretion from infected Pekin ducks （Anasplatyrhynchos）[J]. Journal of virological methods，2012，184（1）：8-14.

[10] World Health Organization. WHO laboratory biosafety guidelines for handling specimens suspected of containing avian infuenza A virus[J]. GENEVA：WHO，2005.

[11] Offce International Des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M]. 7th ed. PARIS：OIE，2012.

[12]Dundon W G，Boscarato L，Mazzacan E，et al. Effect of different temperatures on the stability of avian infuenza reference reagents[J]. Avian diseases，2007，51（s1）：366-369.

Collection，Transportation and Preservation of Swab Samples for Diagnosis and Surveillance of Avian Infuenza

Zhang Xiaochun1，Liu Shuo2，Zhuang Qingye1，Huang Baoxu2，Chen Jiming2

（1. Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150000；
2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

Collection，transportation and preservation of swab samples are important for the diagnosis and surveillance of avian infuenza. The international and national standards and some recent researches in this feld were reviewed here，and the optimal methods were proposed for collection，transportation and preservation of swab samples for diagnosis and surveillance of avian infuenza，so as to provide reference for the diagnosis and surveillance of avian infuenza.

Avian infuenza； Swab samples；Collection；Transportation；Preservation

S855.3 < class="emphasis_bold">文献标识码：A

A

1005-944X（2014）07-0030-04

陈继明