黑素瘤相关MicroRNAs的研究进展

吴 飞宋宁静

黑素瘤相关MicroRNAs的研究进展

吴 飞1宋宁静2∗

近年来发现MicroRNAs可通过膜受体酪氨酸蛋白激酶通路、PI3K－AKT通路、P16INK4ACDK4/6－RB通路、小眼相关转录因子、p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路影响黑素瘤的生物学行为,MicroRNAs及其靶基因相关通路的研究对黑素瘤的早期诊断、预后判断以及黑素瘤的靶向治疗具有重要的意义。

黑素瘤； MicroRNAS； 靶基因； 信号通路

1 M icroRNAs

MicroRNAs是一类内源性、非编码、高度保守的小RNA,主要作用是通过与mRNA的相互作用调节特定基因的表达水平。在胚胎早期发育、细胞增殖和分化、细胞凋亡以及多种肿瘤的发生和发展等一系列重要的生命过程中都有广泛的影响。有学者推测,人类基因组所有基因的表达可能都直接或间接受到MicroRNAs的调节。

与mRNA一样,MicroRNAs主要由RNA聚合酶II转录剪接修饰,最初产物为Pri－miRNA,长度约300～1000个碱基,局部有茎环结构。首先在核内被Drosha RNase切成含有茎环结构的Pre－miRNA,长度约70个碱基。转移至细胞质中后,被Dicer酶切成含有20～24对碱基的RNA双链结构。双链解旋后,其中一条为成熟MicroRNAs,另一条为其互补链。成熟MicroRNAs可与RNA诱导的基因沉默复合物(RNA－induce silencing complex,RISC)结合,形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assemble)。此复合物可通过非严格碱基配对原则与目标基因3'端非编码区结合,形成一种MicroRNA－mRNA链,从而阻止mRNA的翻译,在基因水平影响蛋白的合成。1MicroRNAs参与调控基因表达的机制与siRNA介导的mRNA降解不同,其表达有其严谨的位相性和时相性,在不同组织、不同发育阶段表达都有显著差异。成熟MicroRNAs互补链产生后一般会被立即水解,少部分会长期存在,并有与MicroRNAs相似的作用。

2 M icroRNAs与黑素瘤

黑素瘤发病的过程有明显的步骤:异型黑素细胞首先在局部不典型增生；随后出现放射性生长和垂直性生长形成局部侵袭的原发性黑素瘤；随着肿瘤细胞进一步向真皮侵袭和播散,血管淋巴管形成,肿瘤向远处转移。长期以来学者对于这一转变过程的发生机制进行了大量的研究,近年来相关MicroRNAs对于黑素瘤增殖、侵袭、转移的影响引起了广泛的重视。

Stark对一系列黑素瘤细胞系MicroRNAs表达谱进行了分析,发现目前已知的MicroRNAs中有279种与黑素瘤的各种生物学行为有直接或间接的关系。2然而由于MicroRNAs结构特殊,而且其以一种不完全互补的方式与靶基因结合,导致靶基因难以确定,故其中大部分异常MicroRNAs目前尚无明确意义。此外,由于样本量小,许多研究结论缺乏说服力,各个研究之间的标准不一,也难以进行横向比较。黑素瘤相关MicroRNAs的研究尚不成熟,目前研究主要为以下几条通路:

2.1 膜受体酪氨酸蛋白激酶通路(RAS－RAF－MEKERK) 此通路RAS被各种生长因子(如:干细胞因子、纤维生长因子、肝细胞生长因子等)激活后,可介导RAF的聚集,通过磷酸化作用依次激活丝裂原激活蛋白酶激酶的激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶(ERK)。ERK在黑色素痣中有促细胞有丝分裂的作用。RAS在原发性黑素瘤中突变率为15%～30%,利用RNA干扰技术减少RAS可以降低细胞内ERK水平,并能促进肿瘤细胞凋亡。3后续研究发现RAS是let－7a的靶基因,后者具有抑制RAS表达的作用,可抑制黑素瘤细胞的增殖和侵袭。4此外,活化的ERK可上调整合素β3的表达,促进癌基因的转录。RAF、MEK和ERK均是RAS的下游基因,RAF在黑素瘤中变异率可达50%～70%,其主要变异类型为BRAFV600E,且RAF变异一般不与RAS变异同时发生,故此通路相关的总变异率可达到80%～90%。此外,cKIT基因也可激活此通路,Godshalk认为该激活因素在肢端型和黏膜型黑素瘤亚型中有较强致癌作用。5cKIT是miR－221的靶基因,后者是最早发现的与黑素瘤相关性较大的MicroRNAs之一,Kanemaru运用qRT－PCR对94例黑素瘤患者和20名健康者血清miR－221水平进行检测,发现两者具有明显的差异,并与肿瘤侵犯程度相关,认为其可作为一种可靠的黑素瘤诊断标记物；在原位黑素瘤手术切除后miR－221水平降低,这提示miR－221还可作为一种治疗疗效和预后评估的指标。6miR－221/222也可调节cKIT,还可影响细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂P27的表达,P27对细胞的增殖、凋亡具有调节作用,在黑色素肿瘤由良性向恶性的转变过程中P27表达逐渐消失。7在黑素瘤的发展过程中,当miR－221/222过度表达时,cKIT和p27水平下调。Igoucheva也证实抑制cKIT和p27可使黑素瘤细胞的增殖能力增强。8Mattia还提出ETS－1/miR－222调节轴,即致癌基因ETS－1受到miR－222的调节在转移性黑素瘤中转录性激活miR－221/222,而在痣细胞痣或原位黑素瘤却抑制miR－221/222的表达。9此外miR－214还可通过抑制转录因子AP－2γ(Transcription Factor AP－2 gamma,TFAP2C)间接激活cKIT。10

2.2 PI3K－AKT通路 此通路在大多数转移性黑素瘤中被激活,PI3K被生长因子激活后转变为血清PIP2进一步转化为PIP3,后者可激发AKT磷酸化下游蛋白,从而调控细胞的增殖和凋亡。目前发现仅有miR－125b水平与AKT3呈负相关,可能为miR－125b的靶基因。11在原发性黑素瘤中miR－125b的大幅度下调与肿瘤的早期转移有关,并与前哨淋巴结阳性率有关。12

2.3 P16INK4A－CDK4/6－RB通路 黑素细胞的凋亡衰老常伴有P16INK4A水平的上升。在大多数散发的黑素瘤和30%家族性黑素瘤中P16INK4A会因沉默或变异而钝化。P16可抑制细胞周期蛋白D依赖性激酶(cyclin－D－dependent kinases)CDK4和CDK6,而后两者是维持肿瘤抑制物视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)活性的重要物质。P16INK4A的失活会导致细胞周期蛋白D依赖性激酶的超常活化,通过磷酸化作用使E2F转录因子从RB上分离,从而上调细胞的增殖能力。let－7b通过抑制细胞周期蛋白D1、D3、CDK4和细胞周期蛋白A阻滞细胞周期进程。let－7b在原发性黑素瘤中明显下调。13通过对黑素瘤MicroRNA表达谱的分析发现miR－193b的表达明显低于良性痣细胞痣,高表达的转移性黑素瘤细胞系的增殖和生长的G1期明显被抑制,miR－193b的靶基因为细胞周期蛋白D1,后者是影响细胞周期的主要因素,在包括黑素瘤在内的多种肿瘤中普遍高表达。14miR－205在转移性黑素瘤中的表达明显低于原位黑素瘤和良性痣细胞痣,而重新转染后,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。研究证实miR－205的靶基因为转录因子E2F1。15,16

2.4 小眼相关转录因子(Microphthalmia－associated Transcription Factor,MITF) MITF在细胞的增殖、分化、瘤变中起重要作用。对于细胞外凋亡信号的整合极为重要。MITF可对Dicer基因进行调节,Dicer酶是MicroRNAs形成的关键酶,参与RNA诱导的基因沉默复合物的形成,所以与黑素瘤相关的MicroRNAs都与之相关,对于黑色素细胞的分化、增殖、凋亡和细胞周期有广泛的影响。17有学者认为MITF的水平直接决定色素细胞的发展和最终归宿。在转移性黑素瘤中MITF表达水平上调,并与生存率相关。18最近研究表明MITF对于黑素细胞的调节呈双向性,其表达水平过高或过低都会促进黑素瘤的发生发展。19此外, MITF是最主要的黑素生成转录因子,其功能与细胞内POU3F2基因的表达水平有关。20

由于MITF的这种特性,以其为靶基因的MicroRNAs不能被简单地认为促癌或抑癌作用,MITF的3'非编码区可与miR－137、miR－148/152和miR－124/ 506等许多MicroRNAs的“种子区域”结合。21Goswami还发现MITF还含有另一个较短的3'非编码区, miR－340可以结合这两个非编码区,其作用是维持MITF含量的稳定。22miR－137被认为是调节MITF表达水平的主要因素之一,其表达与MITF呈负相关。23研究表明,在直肠癌中miR－137也具有双重调节作用:既可以抑制肿瘤细胞的生长,又在淋巴结转移的直肠癌中高水平表达。24,25此外,MITF的另一种调节基因miR－506在早期黑素瘤中上调,但在转移性黑素瘤标本中却下调。21MiR－182的靶基因也是MITF,在黑素瘤由原位向转移性发展的过程中伴随着该miRNA的明显上调。当该基因受到抑制时肿瘤细胞的侵袭性下降,凋亡增加,反之转移性增加。26Mueller还发现miR－148在黑素瘤侵袭性生长过程中会明显下调,27对MITF也有重要的调节作用。Mazar认为MITF对miR－211有调节作用,后者在大多数黑素瘤细胞系和标本中都明显下调,与黑素瘤的发展和侵袭有关。其在黑素瘤和痣细胞痣中表达存在显著差异,可能与黑素瘤的成瘤有关。28相对于良性痣细胞痣miR－155在黑素瘤细胞系中下调,miR－155的表达可抑制黑素瘤增殖,增加细胞凋亡,进一步研究发现miR－155的靶基因为SKI。29后者是MITF的强效诱导物,在黑素瘤中常过度表达,有刺激细胞增殖和促进肿瘤转移的作用。30

2.5 p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路 在研究黑素瘤细胞系miR－149－3p的含量时,发现6组野生型p53阳性黑素瘤细胞系miR－149－3p的含量均上调,而另一组p53基因沉默的ME4405细胞株却没有这一现象。31这说明p53有直接上调miR－149－3p的作用,进一步研究发现miR－149－3p与GSK3a的下调和Mcl－1的上调有直接的关系。32而Mcl－1被认为是黑素瘤细胞凋亡的关键因素。33由此p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1通路可能影响黑素瘤细胞凋亡。

以上通路之间存在相互联系和作用,一种MicroRNAs也可在多条通路中发挥作用。也有数种MicroRNAs共同调节某一蛋白表达,其中机制尚待进一步研究。

3 结语

近年来,黑素瘤的死亡率较为稳定,甚至出现了轻度下降,其重要原因为对于该病的早期诊断和手术水平提高,在T1(≤1.00 mm)10年生存率达92%,而T4(＞4.00 mm)仅为50%。34WHO黑素瘤分型主要依据临床表现,然而黑素瘤包含着大量生物学的改变,在体内有众多的信号通路控制其发生发展,根据其生物学行为及信号通路影响特点寻求有意义的生物学标记和治疗靶点将成为黑素瘤治疗的新理念。因此建立一套生物学分型十分必要,在这种分型中MicroRNAs是可能性最大的潜在标志。2007年Gaur等根据当时已知的241种MicroRNAs区分了多种良恶性肿瘤及其亚型,发现3种MicroRNAs(miR－146, miR－204 and miR－211)在黑素瘤中异常表达。35由于MicroRNAs在不同临床类型和各个病程阶段中都有显著特点,每一型黑素瘤都有自身的MicroRNAs表达谱,找出亚型特异性MicroRNAs及其靶基因对黑素瘤的早期诊断和个体化治疗有重要意义。36

1 Filipowicz W,Bhattacharyya SN,Sonenberg N.Mechanisms of posttranscriptional regulation by microRNAs:are the answers in sight?Nat Rev Genet,2008,9(2):102－114.

2 Stark MS,Tyagi S,Nancarrow DJ,et al.Characterization of the melanomamiRNAome by deep sequencing.PLoS One,2010,5 (3):e9685.

3 Eskandarpour M,Kiaii S,Zhu C,etal.Suppression of oncogenic NRAS by RNA interference induces apoptosis of humanmelanoma cells.Int JCancer,2005,115(1):65－73.

4Muller DW,Bosserhoff AK.Integrin beta 3 expression is regulated by let－7amiRNA inmalignantmelanoma.Oncogene,2008, 27(52):6698－6706.

5Godshalk SE,Paranjape T,Nallur S,et al.A variant in amicroRNA complementary site in the 3'UTR of the KIT oncogene increases risk of acralmelanoma.Oncogene,2011,30(13):1542－1550.

6 Kanemaru H,Fukushima S,Yamashita J,et al.The circulating microRNA－221 level in patientswith malignantmelanoma as a new tumourmarker.JDermatol Sci,2011,61(3):187－193.

7 Felicetti F,Errico MC,Bottero L,et al.The promyelocytic leukemia zinc finger－microRNA－221/222 pathway controlsmelanoma progression through multiple oncogenic mechanisms.Cancer Res,2008,68(8):2745－2754.

8 Igoucheva O,Alexeev V.MicroRNA－dependent regulation of cKit in cutaneous melanoma.Biochem Biophys Res Commun, 2009,379(3):790－794.

9Mattia G,Errico MC,PetriniM,et al.Constitutive activation of the ETS－1－miR－222 circuitry in metastatic melanoma.Pigment CellMelanoma Res,2011,24(5):953－965.

10Penna E,Orso F,Tenaglia E,et al.MicroRNA－214 contributes to melanoma tumour progression through suppression of TFAP2C.EMBO J,2011,30(10):1990－2007.

11Glud M,Manfe V,Biskup E,et al.MicroRNAmiR－125b in-duces senescence in human melanoma cells.Melanoma Res, 2011,21(3):253－256.

12Glud M,Rossing M,Hother C,et al.Downregulation ofmiR－125b in metastatic cutaneous malignantmelanoma.Melanoma Res,2010,20(6):479－484.

13Schultz J,Lorenz P,Gross G,et al.MicroRNA let－7b targets important cell cyclemolecules inmalignantmelanoma cells and interfereswith anchorage－independent growth.Cell Res,2008, 18(5):549－557.

14 Chen J,Feilotter HE,Zhang X,et al.MicroRNA－193b represses cell proliferation and regulates cyclin D1 in melanoma. Am JPathol,2010,176(5):2520－2529.

15 Dar AA,Majid S,de Sem ir D,et al.miRNA－205 suppresses melanoma cell proliferation and induces senescence via regulation of E2F1 protein.Biol Chem,2011,286(19):16606－16614.

16Philippidou D,Schmitt M,Moser D,et al.Signatures ofmicroRNAs and selected microRNA target genes in humanmelanoma.Cancer Res,2010,70(10):4163－4173.

17 Vachtenheim J,Borovansky J."Transcription physiology"of pigment formation in melanocytes:central role of MITF.Exp Dermatol,2010,19(7):617－627.

18Gray－Schopfer V,Wellbrock C,Marais R.Melanoma biology and new targeted therapy.Nature,2007,445(7130):851－857.

19 Cheli Y,Giuliano S,Botton T,et al.Mitf is the keymolecular switch between mouse or human melanoma initiating cells and their differentiated progeny.Oncogene,2011,30(20):2307－2318.

20Hoek KS,Goding CR.Cancer stem cells versus phenotypeswitching in melanoma.Pigment Cell Melanoma Res,2010,23 (6):746－759.

21 Haflidadottir BS,Bergsteinsdottir K,Praetorius C,et al.miR－148 regulates Mitf in melanoma cells.PLoS One,2010,5(7): e11574.

22Goswami S,Tarapore RS,Teslaa JJ,et al.MicroRNA－340－mediated degradation of microphthalmia－associated transcription factormRNA is inhibited by the coding region determinantbinding protein.JBiol Chem,2010,285(27):20532－20540.

23Deng Y,Deng H,Bi F,etal.MicroRNA－137 targets carboxyl－terminal binding protein 1 in melanoma cell lines.Int J Biol Sci,2011,7(1):133－137.

24 Bandres E,Agirre X,Bitarte N,et al.Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer.Int JCancer,2009, 125(11):2737－2743.

25 Huang ZM,Yang J,Shen XY,et al.MicroRNA expression profile in non－cancerous colonic tissue associated with lymph nodemetastasis of colon cancer.JDig Dis,2009,10(3):188－194.

26 Segura MF,Hanniford D,Menendez S,et al.AberrantmiR－182 expression promotes melanoma metastasis by repressing FOXO3 and microphthalmia－associated transcription factor. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(6):1814－1819.

27Mueller DW,RehliM,Bosserhoff AK.miRNA expression profiling in melanocytes and melanoma cell lines reveals miRNAs associated with formation and progression ofmalignantmelanoma.J Invest Dermatol,2009,129(7):1740－1751.

28Mazar J,DeYoung K,Khaitan D,etal.The regulation ofmiRNA－211 expression and its role inmelanoma cell invasiveness. PLoSOne,2010,5(11):13779.

29 Levati L,Pagani E,Romani S,et al.MicroRNA－155 targets the SKIgene in humanmelanoma cell lines.Pigment Cell Melanoma Res,2011,24(3):538－550.

30 Chen D,XuW,Bales E,et al.SKIactivatesWnt/beta－catenin signalling in humanmelanoma.Cancer Res,2003,63(20): 6626－6634.

31 Avery－Kiejda KA,Zhang XD,Admas LJ,et al.Smallmolecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA－damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res,2008,14(6):1659－1668.

32 Jin L,Hu WL,Jiang CC,etal.MicroRNA－149∗,a p53－responsivemicroRNA,functions as an oncogenic regulator in humanmelanoma.Proc Natul Acad Sic USA,2011,108(38): 15840－15845.

33 Jiang CC,Lucas K,Avery－Kiejda KA,et al.Up－regulation of Mcl－1 is critical for survival ofhumanmelanoma cells upon endoplasm ic reticulum stress.Cancer Res,2008,68(16):6708－6717.

34 Balch CM,Gershenwald JE,Soong SJ,et al.Final version of 2009 AJCCmelanoma staging and classification.JClin Oncol, 2009,27(36):6199－6206.

35Gaur A,Jewell DA,Liang Y,et al.Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines.Cancer Res,2007,67(6):2456－2468.

36 Nana－Sinkam SP,Fabbri M,Croce CM.MicroRNAs in cancer:personalizing diagnosis and therapy.Ann NY Acad Sci, 2010,1210:25－33.

(收稿:2013－04－16 修回:2013－08－04)

M icroRNAs in melanoma

WU Fei,SONGNing-jing.Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai,200443

MicroRNAs can affectmelanoma biology through multiple signaling pathways(RAS－RAF－MEK－ERK,PI3K－AKT,P16INK4A－CDK4/6－RB,MITF,p53－miR－149－3p－GSK3α－Mcl－1).Researches on MicroRNAs are of significance in early diagnosis,prognostic judgment and target therapies ofmelanoma.

melanoma；MicroRNAs；target gene；signaling pathways

1安徽医科大学上海皮肤性病临床学院,上海,200443

2上海市皮肤病医院,上海,200443

∗通信作者