LTA对BALB/c幼鼠肠黏膜TLR4表达的影响

，(.南华大学附属第一医院烧伤整形外科，湖南 衡阳 400；.湖南省环境生物学院生物化学教研室)

LTA对BALB/c幼鼠肠黏膜TLR4表达的影响

周昌宁1，曹海宁2
(1.南华大学附属第一医院烧伤整形外科，湖南 衡阳 421001；2.湖南省环境生物学院生物化学教研室)

目的探讨脂磷壁酸(LTA)对BALB/c幼鼠肠黏膜Toll样受体4(TLR4)表达的影响。方法将30只1周龄BALB/c幼鼠随机分为正常组、溶媒组和LTA组，分别给予NS、DMSO和LTA各0.1 mL一次性灌胃处理，并于处理后第1周、第2周和第4周分别取幼鼠回肠末端、回盲部及结肠组织，HE染色观察各段组织病理学变化，免疫组化检测TLR4蛋白表达情况。结果HE染色显示与正常组相比，溶媒组和LTA组幼鼠肠黏膜组织均有炎性浸润尤以经LTA处理后第1周的回肠末端最明显：其黏膜结构完整性受损，黏膜间隙增宽，炎性细胞浸润，大量细胞气球样变性甚至坏死。免疫组化结果表明各组不同组织不同时间段均表达TLR4;LTA组表达量最高，与正常组和溶媒组相比差异均有显著性(P<0.05)；各组同一组织TLR4表达随时间延迟表达量增多以第4周最高，与第1周和第2周相比差异有显著性(P<0.05)；相同组织在不同组别以结肠表达最高并随时间延长而增加(P<0.05)；第4周LTA组结肠组织表达量最高，差异均有显著性(P<0.05)。结论LTA能上调肠黏膜TLR4表达并随着时间延长而增加，其对LTA识别和反应部位可能主要位于结肠。

脂磷壁酸； 肠黏膜； 二甲基亚砜； TLR4

肠道是人体最大的免疫器官[1]，在机体防御和清除外来抗原中起着重要作用。肠道免疫系统的主要组成部分是肠黏膜免疫[2]，现已逐渐发展成一门独立的学科，其研究领域含盖先天性免疫和获得性免疫等方面。肠道细菌总数达1014以上，远远超过体细胞数量1013，这些肠道细菌通过表达病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)来被先天性免疫系统中的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)所识别[3]。新生儿肠道是无菌的，肠黏膜免疫系统尚未发育，随着肠道菌群的定植，肠道黏膜免疫系统逐步发育完善，因而肠道菌群被认为是肠黏膜免疫系统发育和成熟的始动因素。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是先天性免疫系统中的一类重要的PRRs，TLRs通过与PAMP结合启动肠黏膜免疫[4]，激活细胞内信号转导通路，分泌各种趋化因子和细胞因子来发挥抗感染免疫作用，因而被认为是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。在肠黏膜免疫中一般认为TLRs家族中TLR4与共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及肠道共生菌的耐受相关。目前对肠黏膜免疫的研究主要集中于革兰氏阴性细菌及其细胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[5]，而对革兰氏阳性细菌及其细胞壁成分LTA在黏膜免疫中的作用报道较少。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡萄球菌脂磷壁酸(LTA 5 mg/支) 购自Sigma公司，用DMSO配成0.1 mg/mL溶液。DMSO 由南华大学免疫与微生物教研室惠赠。免疫组化相关试剂：TLR4单克隆抗体鼠购自 Abgent公司，SP免疫组化试剂盒DBA显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

将30只1周龄BALB/c幼鼠随机分为三组：正常组、溶媒组和LTA组，每组10只，分别给予NS(阴性对照)、DMSO(溶媒对照)和LTA 0.1 mL一次性灌胃处理并于处理后第1周、第2周、第4周取出幼鼠回肠末端、回盲部、结肠，HE染色观察各段组织病理学变化，免疫组化检测TLR4蛋白表达情况。在每张免疫组化切片中随机选取5个不连续的视野(×200)，采用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件进行图像分析，分析同时相点各个视野TLR4阳性细胞表达的积分光密度值(integral optical density,IOD)。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 回肠末端黏膜组织学变化

正常组BALB/c幼鼠回肠末端可见绒毛结构且绒毛细而短，可见杯状细胞、柱状细胞；回盲部可见淋巴滤泡、淋巴小结及弥散淋巴组织；结肠内未见绒毛但在固有层内可见散在的结肠腺。溶媒组BALB/c幼鼠回肠末端肠黏膜较完整，且肠黏膜稍水肿，细胞间隙略增宽甚至可见少量炎性细胞浸润，第1周改变最明显，第2周后炎性反应消失；回盲部可见淋巴滤泡反应性增生，结肠固有层内可见散在的结肠腺。LTA组BALB/c幼鼠回肠末端黏膜结构完整性破坏，黏膜面可见大量细胞呈气球样变性甚至发生坏死，细胞间隙明显增宽，尤以LTA处理后的第1周改变最显著(图1)；回盲部可见大量淋巴结和淋巴滤泡反应性增生；结肠固有层反应性增生，肠腺偶见变性水肿及炎性细胞浸润。第2周后炎性反应开始逐渐消失。

2.2 TLR4免疫组化及图象分析

三组各个部位肠黏膜不同时间段均表达TLR4，见图2。各组TLR4阳性细胞积分光密度值(integral optical density,IOD)：LTA组表达量最高，与正常组和溶媒组相比差异均有显著性(P<0.05)；各组同一组织TLR4表达随时间延迟表达量逐渐增多以第4周最高，与第1周和第2周相比差异均有显著性(P<0.05)；相同组织在不同组别以结肠表达最高并随时间延长而增加，差异均有显著性(P<0.05)；第4周LTA组结肠组织表达量最高(P<0.05，表1)。

3 讨 论

自上个世纪的50年代后期Burnet提出克隆选择学说以来对获得性免疫系统的研究取得了突飞猛进的进展，甚至曾一度独占免疫学舞台。直至90年代后期多种天然免疫识别分子的结构、功能及分子机制被发现导致了天然免疫的迅速崛起。Nature2001年第410卷有文献报道：天然免疫这个“灰姑娘”将在21世纪登上免疫学舞台的中心。肠道不仅是消化器官而且是最大的免疫器官,肠道细菌总数达1014，种类超过了1 000种[6-7]。如何保持这些细菌正常地发挥功能非常重要,尤其对于婴幼儿处于免疫系统发育的关键时期，可以影响到婴幼儿生长发育甚至是远期健康状况。婴幼儿肠道共生菌群含大量需氧菌，这些需氧菌在革兰氏阴性细菌以大肠杆菌为代表，在革兰氏阳性细菌以金黄色葡萄球菌为代表，它们在体内代谢可以释放其细胞壁成分LPS 、LTA等，能持续作用于肠黏膜。TLRs是先天性免疫系统中的一类重要的PRRs，目前至少已报道了13种TLR[8]，在肠黏膜免疫方面普遍认为TLR4与肠道共生菌定植、抵抗病原微生物入侵以及肠道共生菌的耐受密切相关。在静息状态下TLR4表达于细胞表面就可以更好的识别细菌细胞壁上的抗原性成分LPS 、LTA 。TLR4在识别这些细菌的PAMP后被活化并诱导相关基因的表达[9]。哺乳动物肠道共生菌的定植是出生后逐步建立形成的，婴幼儿时期肠道菌群的密度及种类在不同个体或同一个体的不同部位是有差异的，但相对于个体而言其肠道细菌在一定时期内同一部位相对衡定[10]。可见探讨出生后经胃肠道荷载LTA对肠道不同部位TLR4表达变化对深入了解肠黏膜免疫作用机制有着重要的意义。

表1BALB/c幼鼠各组肠道各段在不同时间点TLR4的IOD表达情况(n=5)

与LTA组同时间比较，a：P<0.05；与同一组织第4周表达比较，b：P<0.05；与LTA组第4周结肠比较，c：P<0.05；与同组结肠表达比较， d：P<0.05

本实验经胃肠道荷载LTA于BALB/c幼鼠，观察肠组织各段改变为研究肠黏膜免疫提供实验依据，通过免疫组化观察TLR4表达的变化了解TLR4在肠黏膜免疫中的作用提供一定的理论依据。从实验结果来看无论是通过NS、DMSO 还是LTA处理，TLR4在BALB/c幼鼠回肠末端、回盲部到结肠都是有表达的。从表达部位来看：回肠末端表达最低，回盲部次之而结肠表达最高；从处理因素来看：正常组表达最低，溶媒组次之，LTA组最高，说明LTA在实验计量条件下可以刺激肠道发生炎症反应但随着肠道黏膜免疫发育成熟炎症反应逐渐减弱甚至消失。DMSO也具有一定的消化道毒性，可以诱导先天免疫应答；从表达时间来看：第4周表达最高，第1周表达最低，可能与此期小鼠肠黏膜免疫系统已发育成熟有关。虽然DMSO具有一定的消化道毒性可以诱导先天免疫应答，但LTA更能明显上调TLR4的表达，且表达强度明显高于DMSO，表达水平与LTA 作用时间相关，说明LTA能明显增强TLR4表达，且其表达水平与LTA作用时间有密切相关。总之，TLR4在BALB/c幼鼠回肠末端、回盲部到结肠都有基础性的表达，经胃肠道荷载实验计量条件下，DMSO、 LTA可以诱发肠道炎症反应尤以LTA明显，且结肠部位TLR4表达明显高于回肠末端和回盲部，提示肠道对LTA识别和反应的部位主要发生于结肠。

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ChangesofExpressionofTLR4InducedbyLTAinIntestinalMucosaofBALB/cMicePups

ZHOU Changning，CAO Haining
(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the expression of TLR4 in intestinal mucosa of BALB/c mice pups.Method30 BALB/c mice postnatal one week were randomly divided into normal group,solvent group and LTA group,and were administrated with NS,DMSO or LTA 0.1ml one time,respectively.The pups intestine were taken out at the first,second and fourth week and the terminal ileum,cecum and colon were separated.The pathological change of the tissues were analyzed by HE staining and the expression of the TLR4 were detected by immunohistochemistry (IHC).ResultHistological examination showed that inflammatory infiltration was observed in solvent control group and LTA group.The integrity of mucosal structure was injured,the gap of the mucosa was widened and inflammatory cell infiltration or ballooning degeneration even necrosis was observed,especially in the terminal ileum of the LTA group at first week.The results of the immunohistochemistry indicated that the expression of TLR4 were detected in different tissues at different time period in three groups; the expression level of TLR4 in LTA group was the highest,compared with normal group and solvent group (P<0.05); The expression of TLR4 in the same tissues of different groups were increased over time and the level of TLR4 at the fourth week were higher when compared with which at the first or second week(P<0.05); the expression of TLR4 in colon were the highest and increased over time and the level of TLR4 in colon at the 4th week was the highest(P<0.05).ConclusionLTA can up-regulate the expression of TLR4 in the intestinal mucosa,and the site of the LTA recognition and reaction may be mainly located in the colon.

Lipoteichoic acid； intestinal mucosa； Dimethyl sulfoxide； TLR4

2095-1116(2014)05-0455-04

2014-05-30

周昌宁，博士，主治医师，研究方向：烧烫伤所致肠源性感染，E-mail:zcn8888@sina.com.

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(此文编辑：蒋湘莲)