人参三肽的序列分析

王 颖，陈英红，罗浩铭，姜瑞芝，姜翔之

（1.吉林省中医药科学院中医药基础所，长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院，长春 130033）

人参三肽的序列分析

王 颖1，陈英红1，罗浩铭1，姜瑞芝1，姜翔之2

（1.吉林省中医药科学院中医药基础所，长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院，长春 130033）

采用Sephadex LH－20色谱柱，以体积分数10%的甲醇为流动相分离人参中具有增强记忆活性的肽类成分，通过高效液相色谱系统将其纯化，并用蛋白质测序仪分析其氨基酸序列.结果表明，所得序列为Gln－Thr－Ser的新三肽.

人参；氨基酸；序列分析；三肽

人参（PanaxginsengC.A.Mey.）为五加科植物，是我国名贵的中草药.目前对人参中肽的研究较多，但都未给出其一级结构［1－6］.人参水提物中分子量相对较低的部分具有增强小鼠记忆的作用［7］，分离纯化该部分可得寡糖、糖肽与肽部分，药理实验表明，具有增强记忆作用的活性部位为肽类［6］.本文对此肽类成分经Sephadex LH－20柱以及高相液相色谱系统进一步纯化后，通过序列分析，得到三肽结构，为首次从人参中提取，并确定其一级结构.

1 试剂与仪器

人参多肽（PGP1）为吉林省中医药科学院中医药基础所制备［6］.L－色氨酸、细胞色素C、抑肽酶和维生素B12购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，质量分数≥98%；Sephadex LH－20为美国Sigma公司产品；玻璃纤维膜、聚四氟乙烯（PTFE）滤膜、聚凝胺和混合氨基酸标品（PTH－AA）均为日本岛津公司产品；其他试剂为国产分析纯.

754紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；BSZ－100A型自动部分收集器，HL－1恒流泵（上海精科实业有限公司产品）；Christ Alphal－2型冷冻干燥机（德国Christ公司）；高效液相色谱系统（HPLC，日本岛津公司）：10AT－VP泵、紫外检测器和PPSQ－31A型蛋白质测序仪（日本岛津公司）；快速蛋白液相色谱（FPLC）系统（瑞典Pharmacia公司）.

2 方 法

2.1 PGP1的纯化 称取235 mg PGP1，加入p H＝7.0的磷酸钠缓冲液1 m L，溶解后通过Sephadex LH－20（2.5 cm×95 cm）分离［8］，以p H＝7.0磷酸钠缓冲液洗脱，流速0.1 m L／min，每管2 m L，以280 nm的吸收值对肽进行监测，绘制洗脱曲线.

2.2 人参三肽的制备 1）HPLC纯化：采用凝胶分析柱（OHpak SB－802型，日本Shodex公司），流动相为p H＝7.0的磷酸盐缓冲液，流速0.5 m L／min，柱温35℃，检测波长280 nm.2）FPLC质量分数鉴定：采用MonoQ柱（HR10／5柱，瑞典Pharmacia公司），流动相为0.1 mol／L NaCl［9］，流速1 m L／min，柱温30℃，检测波长280 nm.

2.3 氨基酸序列分析 利用PTH－AA生成标准品色谱图，对混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件.将15μL聚凝胺置于玻璃纤维膜上，氮气吹干.将样品加至预处理后的玻璃纤维膜上，氮气吹干，用PTFE滤膜封置于蛋白测序仪的反应器内，设定检测氨基酸数进行检测.

3 结果与讨论

3.1 人参多肽的纯化 PGP1通过Sephadex LH－20凝胶柱纯化的洗脱曲线如图1所示.由图1可见，洗脱曲线存在3个峰.第二个峰的吸收值相对较高，即样品的质量分数相对较高，收集此部分，浓缩冻干，命名为PGP1a.

3.2 HPLC法制备三肽 利用HPLC测定PGP1a的质量分数，结果如图2所示.由图2可见，其HPLC谱存在3个单峰.分别富集此3个组分，通过FPLC测定其质量分数，结果显示保留时间为21.21 min的组分质量分数最高，富集此部分，命名为PGP1aa.

图1 PGP1的Sephadex LH－20凝胶柱纯化洗脱曲线Fig.1 Elution profile of PGP1 purified by DEAE－Sephadex LH－20 column

图2 PGP1a的HPLC谱Fig.2 HPLC spectrogram of PGP1a

图3 PGP1aa的氨基酸序列分析色谱Fig.3 Amino acid sequence spectrograms of PGP1aa

3.3 氨基酸序列分析 采用蛋白质测序仪对PGP1aa进行测序，结果如图3所示.由图3可见，序列为Gln－Thr－Ser.

综上所述，本文采用Sephadex LH－20凝胶柱与HPLC对人参多肽进行分离纯化，再通过蛋白质测序仪测定氨基酸序列，得到了序列为Gln－Thr－Ser的三肽.此三肽为首次从人参中分离纯化得到，并确定了其结构.

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Sequential Analysis of Tripeptide fromPanaxginseng

WANG Ying1，CHEN Yinghong1，LUO Haoming1，JIANG Ruizhi1，JIANG Xiangzhi2
（1.InstiuteofBasicTraditionalChineseMedicine，JilinAcademyofChineseMedicineand MaterialMedicaScience，Changchun130012，China；2.China－JapanUnionHospital，JilinUniversity，Changchun130033，China）

The peptides，which show enhanced memory effect，fromPanaxginsengwere separated on a Sephadex LH－20 column，the mobile phase was volume fraction 10%of methanol，and purified by HPLC.Then the amino acid sequence was analysed by protein sequencer.The results of amino acid sequential analysis showed that a novel tripeptide whose amino acid sequence is Gln－Thr－Ser was obtained.

Panaxginseng；amino acid；sequential analysis；tripeptide

R932

A

1671－5489（2014）04－0852－03

10.13413／j.cnki.jdxblxb.2014.04.43

2013－11－06.

王 颖（1981—），女，汉族，博士，从事天然药物化学的研究，E－mail：wangying02231＠sina.com.通信作者：姜翔之（1956—），男，汉族，主管药师，从事临床药学的研究，E－mail：zhongyanjrz＠sina.com.

国家自然科学基金（批准号：81173532）、吉林省科技发展计划项目（批准号：20130206046YY）和吉林省中医药管理局中医药科技项目（批准号：2012－114）.

单 凝）