姜黄素对自发性高血压大鼠脑缺血／再灌注后海马神经元损伤及RANTES表达的影响*

俞陈陈，胡 涵，汪小丹，曹 红，姬 斌，李 军

（温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江温州325027）

高血压是引起缺血性脑病的主要危险因素，缺血性脑病是危害人类健康的三大疾病之一，而溶栓之后可引起严重的再灌注损伤。有研究表明，调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（regulatedupon activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES）是介导脑缺血／再灌注损伤炎症反应的重要因素之一［1］。目前静脉用组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA）是美国FDA唯一批准用于治疗急性缺血性脑卒中的药物，tPA在脑卒中发生3 h内给予发挥最佳效果，仅有4%的脑缺血患者受益于此［2］。姜黄素是由姜黄中提取的有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学作用。有研究表明，姜黄素可通过抑制RANTES表达减轻星形胶质细胞介导的急性脊髓损伤，姜黄素的抗炎效应可用于治疗各种神经炎症和神经退行性疾病，包括急性脊髓损伤后的创伤性炎症［3］。本研究探讨自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）在全脑缺血／再灌注后海马神经元损伤和RANTES在海马CA1区的动态变化，及姜黄素对SHR缺血性神经元损伤的保护作用与抑制RANTES蛋白表达的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

HE染色盒购自北京索莱宝科技有限公司，Nissl染色盒购自碧云天生物技术研究所，大鼠趋化因子（RANTES）ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，姜黄素购自美国Sigma公司，用玉米油配置成20mg／ml贮存液，避光于 4℃冰箱保存，Olympus Cx21倒置显微镜购自日本Nikon公司，Multiskan Mk3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 动物分组

与雄性WKY大鼠同源的 SHR 90只和雄性WKY大鼠60只，SPF级，8周龄，体重（180～200）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证编号：SCXK（京）2012-0001）提供，在 22～25℃实验室中饲养7 d以适应实验室环境。SH标准：安静状态下尾动脉收缩压＞160 mmHg。采用随机数字表法，将WKY大鼠随机分为2组（n＝30）：假手术组（WSham组）、缺血／再灌注组（W-I／R组），将 SHR随机分为3组（n＝30）：假手术组（S-Sham组）、缺血／再灌注组（S-I／R组）、姜黄素组（S-Cur组）。以上各组再根据再灌注时间，分为 3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d五个亚组。各组处理：W-Sham组和S-Sham组仅分离双侧颈总动脉但不夹闭；S-Cur组于再灌注30min时腹腔注射姜黄素100mg／kg（本课题组前期实验结果表明，100mg／kg剂量的保护作用优于 30 mg／kg和300mg／kg）：其他组别于再灌注30 min时腹腔注射等容积玉米油。

1.3 模型制备

大鼠全脑缺血／再灌注模型的制备参照文献［4］介绍的四血管阻断法制备全脑缺血／再灌注模型。腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg／kg麻醉下，双极电凝器电凝双侧椎动脉，并分离双侧颈总动脉，穿线备用，24 h后于清醒状态下应用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉（阻断椎动脉后若即刻夹闭双侧颈动脉实施缺血／再灌注，大鼠死亡率高，模型成功率非常低），使全脑缺血10 min，然后恢复灌注。脑缺血时维持大鼠直肠温36.5～37.5℃。以缺血动物60 s内发生翻正反射消失、四肢僵直、眼球苍白、瞳孔散大等为脑缺血成功的标准，不合标准者剔除。

1.4 行为学观察

再灌注后7 d用跳台试验观察大鼠学习记忆能力。跳台装置为30 cm×30 cm×40 cm的被动回避反应箱，箱底铺直径1 mm铜栅，通36 V交流电，箱壁由黑色塑料板围成，铜栅的一角固定5 cm×5 cm×5 cm大小的塑料泡沫块作为动物回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中训练5min，并记录首次找到安全区所需的时间（反应时间）和5 min内受到的电击次数（错误次数），作为学习成绩。24 h后重复上述实验，记录第1次跳下安全区的时间（潜伏期）和错误次数，作为记忆成绩。实验在安静房间内进行。整个实验过程中保持室内灯光等周围环境条件的一致。所有行为学观察由同一组实验员完成。

1.5 组织学切片

于再灌注 3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d时将大鼠麻醉，开胸经升主动脉插管，依次灌注生理盐水150 ml和4%多聚甲醛溶液150 ml，断头取脑，在视交叉后1mm和4mm处冠状面切开，取中间脑组织置于同一多聚甲醛溶液中固定1 d，再置于10%福尔马林溶液中固定1 d，石蜡包埋。在大鼠脑冠状切面海马水平连续冠状切片，片厚4μm。

1.6 HE染色观察锥体细胞形态

切片常规脱蜡至水，苏木素初染，伊红复染，脱水、透明、中性树胶封片，观察海马CA1区锥体细胞的形态。

1.7 Nissl染色计数平均锥体细胞密度

切片常规脱蜡至水，甲苯胺蓝染色，脱水、透明、中性树胶封片，高倍镜下计数海马CAl区每mm区段内正常锥体细胞数目（胞膜皱缩、尼氏体消失者剔除），即锥体细胞密度。双侧海马锥体细胞密度取平均值为平均锥体细胞密度［5］。各组平均锥体细胞密度以均数 ±标准差（¯x±s）表示。

1.8 ELISA法测定海马RANTES蛋白表达水平

于再灌注3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d时取 3只大鼠，断头取脑，快速分离海马，加适量细胞裂解液进行低温匀浆，提取总蛋白并根据BCA法测定样本蛋白浓度后备用。采用ELISA法测定RANTES浓度，按照RANTES-ELISA试剂盒说明书进行测定。采用酶标仪测定450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算实际浓度。根据稀释倍数和组织的总蛋白浓度计算出单位质量海马组织中RANTES的质量，以pg／mg表示。

1.9 统计学处理

所有计量数据均以均值±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS 19.0统计软件分析，组间比较采用单因素方差分析，组内差异采用随机区组资料设计。

2 结果

2.1 姜黄素对大鼠行为学的影响

W-Sham组和S-Sham组大鼠学习、记忆成绩无差别。S-I／R组大鼠学习成绩和记忆成绩较W-I／R组有显著下降（P＜0.05）。缺血／再灌注后，S-I／R组大鼠学习成绩和记忆成绩较S-Sham组大鼠明显下降（P＜0.05）。S-Cur组大鼠学习成绩和记忆成绩与 S-I／R组大鼠比较有所改善（P＜0.05，表 1）。

2.2 姜黄素对海马锥体细胞形态的影响

光镜下可见W-Sham组和S-Sham组大鼠海马各区锥体细胞排列整齐、密集，胞体呈锥体形，边界清楚；细胞核大，呈圆形或椭圆形，核膜清晰，核仁明显。W-I／R组和S-I／R组大鼠海马CA1区锥体细胞排列稀疏，胞质嗜伊红染，核固缩深染，S-I／R组损伤更严重。再灌注后1 d、3 d、7 d海马CA1区锥体细胞数目减少，排列散乱，凋亡小体形成，部分细胞核呈碎片状。S-Cur各组大鼠锥体细胞轮廓尚清，核形状规则（图1见彩图页Ⅱ）。

Tab.1 Comparison of learning andmemory ability among different groups（¯x±s，n＝6）

2.3 姜黄素对海马锥体细胞密度的影响

与W-Sham组大鼠比较，W-I／R组大鼠于再灌注后1 d，3 d，7 d时间点海马CA1区锥体细胞密度减少（P＜0.05）；与 S-Sham组大鼠比较，S-I／R组大鼠于再灌注后12 h，1 d，3 d，7 d时间点海马 CA1区锥体细胞密度减少（P＜0.05）；S-Sham组和 S-Cur组大鼠锥体细胞密度无差别；与S-I／R组大鼠比较，SCur组大鼠于再灌注后1 d，3 d，7d时间点海马CA1区锥体细胞密度增加（P＜0.05，表 2）。

2.4 姜黄素对海马RANTES表达的影响

与W-Sham组大鼠比较，W-I／R组大鼠于再灌注后12 h，1 d时间点海马RANTES蛋白表达上调（P＜0.05，表3），S-Sham组大鼠再灌注后海马 RANTES蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）；与 W-I／R组和S-Sham组大鼠比较，S-I／R组大鼠分别于再灌注后3 h，12 h，1 d和 3 h，12 h，1 d，3 d，7 d时间点海马RANTES蛋白表达上调（P＜0.05）；与 S-I／R组大鼠比较，S-Cur组大鼠于再灌注后 12 h，1 d，3 d，7 d时间点海马 RANTES蛋白表达下调（P＜0.05）；S-I／R组大鼠海马RANTES蛋白在再灌注后3 h可见表达升高，于1 d达高峰，随后逐渐下降至7 d。

Tab.2 Comparison of density of vertebral cell in hippocampal CA1 region at different time pointafter reperfusion（cells／mm，¯x±s，n＝3）

Tab.3 Comparison of expression of RANTES in hippocampal of different group at different time point after reperfusion（pg／mg，¯x±s，n＝3）

3 讨论

本实验采用全脑缺血／再灌注（I／R）模型，研究各组WKY大鼠、SHR在各再灌注时间点海马CA1区神经元损伤和RANTES表达的变化及再灌注后7 d学习、记忆能力。WKY大鼠和SHR在脑I／R后海马CA1区神经元损伤加重，RANTES蛋白表达上调，再灌注后7 d学习和记忆能力下降。与WKY大鼠相比，SHR在脑I／R后海马CA1区锥体细胞损伤加重，RANTES蛋白表达上调，再灌注后7 d学习和记忆能力下降。本实验表明再灌注后30 min腹腔注射100mg／kg姜黄素能减轻I／R后SHR海马CA1区椎体细胞损伤，抑制RANTES蛋白表达，改善学习和记忆能力。但本研究结果为该课题组的初步成果，有待以后增加样品量进行深入研究。

高血压是一种慢性炎症反应［6］。在高血压的情况下，血管周围脂肪组织RANTES蛋白表达上调［7］。在长期高血压的情况下，中枢神经系统结构和功能会发生改变［8］。自发性高血压大鼠随着年龄增长，海马CA1区和齿状回区容积及神经元数目逐渐减少，星形胶质细胞逐渐增多［9］。我们前期研究表明自发性高血压大鼠脑I／R后海马CA1区损伤程度明显重于正常血压大鼠，学习和记忆能力也显著下降［10-11］。RANTES是趋化因子CC亚家族中的一员，由91个氨基酸组成，CCR5属于G蛋白偶联受体超家族，是RANTES的受体。RANTES介导的炎症反应可能是引起脑I／R神经元损伤的机制之一［1］。缺血缺氧、应激、创伤等都可引起脑缺血损伤，使小胶质细胞产生神经毒性物质氧化亚氮、自由基和各种细胞因子（IL-1、IL-6和 TNF-α等），激活星形胶质细胞表达RANTES，RANTES与炎症细胞（白细胞、巨噬细胞等）表面 CCR5结合，通过激活 PI-3K而使 Akt／PKB表达，使炎症细胞粘附并趋化，RANTES与CCR5结合还可促使细胞内钙离子释放并与DAG结合，激活ERK1／2表达引起炎症细胞增殖，加重脑损伤［12，13］。Terao等［1］研究表明，RANTES基因敲除小鼠大脑中动脉 I／R模型中，IL-6、IL-10和IL-12表达减少，脑梗死面积缩小，血脑屏障功能得到改善。本实验表明，WKY大鼠和 SHR在脑 I／R后海马 CA1区神经元损伤加重，RANTES蛋白表达上调，再灌注后7 d学习和记忆能力下降，提示RANTES可能参与脑I／R损伤。与WKY大鼠相比，SHR全脑I／R后海马CA1区神经元损伤增加，RANTES蛋白表达上调，提示高血压情况下可能更易发生RANTES介导的脑缺血性损伤。

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，对姜黄素的分子药理学研究表明，姜黄素具有多方面药理作用，如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等作用。姜黄素可减少肾缺血损伤时RANTES蛋白的过度表达［14］，也可明显抑制急性脊髓损伤时星形胶质细胞 RANTES表达［3］。曹红［15］等人研究表明，姜黄素可显著减少沙土鼠I／R后海马CA1区凋亡锥体细胞数量，诱导Fos蛋白及抑制NF-kB蛋白的表达。前期研究表明姜黄素可通过凋亡通路抑制海马c-jun、c-fos和JNK3等蛋白表达减轻 SHR脑 I／R损伤［10，16］。姜黄素是否能通过抑制SHR脑I／R损伤炎症反应影响海马RANTES的表达鲜有报道。本实验发现，给予100 mg／kg姜黄素能显著减少I／R后SHR海马CA1区损伤的神经元，同时明显抑制RANTES的表达。提示姜黄素可能通过抑制RANTES的表达，对SHR脑I／R损伤发挥神经保护效应。

综上所述，I／R更易导致SHR海马神经元损伤。姜黄素减轻SHR脑I／R海马神经元损伤，其机制可能与抑制RANTES蛋白的表达有关。

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