MicroRNA与缺血性脑卒中关系的研究进展

保玉莲 综述 朱榆红 审阅

1）昆明医科大学第五附属医院神经内科 个旧 661000 2）昆明医科大学第二附属医院神经内科 昆明 650101

MicroRNA是一类真核生物中广泛存在的内源性、非编码、单链、小分子RNA，长度19～25个核苷酸，这些小分子RNA能够识别特定的目标mRNA，并在转录后水平对基因的表达进行负调控。1993年，Lee RC等［1］发现了第一个能阶段性调控胚胎后期发育的基因lin－4，这一发现在当时未引起足够重视，2000年，Reinhart等［2］又在线虫C.elegans中发现了第2个异时性开关基因let－7。在此之后，许多研究小组分别在线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和人类等多种真核模式生物和细胞中找到了1 000多个类似的小分子RNA［3］，开启了人类研究miRNA的里程。在真核细胞内，RNA聚合酶Ⅱ从miRNA编码基因转录出初级转录本，即pri－miRNA。在细胞核内，pri－miRNA经过Drosha酶切割成长70～100个碱基、具有发夹结构的miRNA 的前体，即pre－miRNA，pre－miRNA又通过核输出蛋白（exportin5）转运到细胞质，被核糖核酸酶（Dicer）切割成19～25个核苷酸大小的成熟双链miRNA产物，然后在解螺旋酶的作用下，双链miRNA解开，其中一条链被降解，另一条链先后与dicer和ago蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA－induced silencing complex，RISC），RISC内的 miRNA与靶 mRNA 3’非编码区（3’－UTR）内特异序列互补结合，影响 mRNA的成熟、转运及稳定性，或直接调控mRNA的翻译过程，从而降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译而发挥调控作用［4］。

随着生命科学的不断发展和对基因研究的深入探索，对miRNA的研究也越来越多。生物信息学分析显示，人类约有1／3基因编码的mRNA受到miRNA的负调控［5］。miRNA不仅参与了细胞的分化、生长、增值及凋亡过程［6］，而且还在一些疾病的发生、发展过程中起着重要的调控作用［7］。

miRNA的分布及表达具有组织特异性，也就是说，机体不同的组织中存在不同高表达量的miRNA。Sempere等［8］首次在人和小鼠的神经细胞中检测出7个脑组织特异性miRNAs（miR－9、－124a、－124b、－129、－135、－153、－183）。 Hua等［9］对大鼠不同组织中152种miRNAs的表达特异性研究显示，有30种miRNAs特异性表达于大鼠神经组织中，如let－7、miR－21、－124、－128、－199、－429 等。Linsen等［10］在 大 鼠的脑组织中检测出了133种miRNAs，而在睾丸和肝脏组织中仅分别发现35种及9种miRNAs，说明大鼠的脑组织中存在数量最多的 miRNA。Weng等［11］研究表明，miR－124、－219、－346是脑组织中表达较丰富的几类miRNAs，其中以miR－124最具有脑组织特异性，参与了神经元分化、神经生长发育以及脑组织损伤后的调控，通过检测大脑中动脉阻塞模型的大鼠血浆miR－124浓度，发现miR－124在脑缺血6h后即开始升高，一直持续到48h以后。

随着人口老龄化和经济水平的快速发展以及生活方式的改变，人类缺血性脑卒中的发病率明显上升。不同的发病类型、不同的病因、发病机制、临床表现，采用不同的治疗方法，患者会有不同的预后。

基于上述原因，miRNA与缺血性脑卒中的相关性研究也越来越受到分子生物学家及临床神经病学家的青睐。目前miRNA与脑血管病的研究才刚刚起步［12］，下面就近年来关于miRNA在缺血性脑卒中几个重要的病理生理变化过程中的相关性研究做一简单介绍。

1 miRNA与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（AS）是缺血性脑卒中最主要的危险因素，动脉粥样硬化斑块的形成是动脉粥样硬化的标志。内皮细胞损伤、脂质沉着、单核巨噬细胞聚集、吞噬以及炎性反应等是动脉粥样硬化斑块形成的重要过程。

1.1 miRNA与血管内皮细胞内皮细胞功能失调是AS的启动因素，促进了单核巨噬细胞的聚集、吞噬作用以及细胞外基质的慢性炎症反应，并导致脂质在内膜下沉积，形成粥样斑块。近年来许多研究表明miRNA可参与调控内皮细胞的功能障碍。Qin等［13］研究发现，miR－let－7c可通过抑制Bcl－x1的表达，促进内皮细胞的凋亡而参与促进动脉粥样硬化的形成。相反地，Zernecke等［14］研究则发现，miR－126可通过加强内皮细胞的修复而发挥抗动脉粥样硬化的作用。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，通过增殖、分化、成熟后，起到修复损伤血管，改善内皮功能的作用。研究发现，冠心病病人的内皮祖细胞数目减少，且其内皮祖细胞中miR－221和miR－222的表达要高于正常人［15］，而应用降脂药物阿托伐他汀治疗后这两种miRNAs的表达能够明显下调，说明miR－221和miR－222参与血脂调节和动脉粥样硬化斑块的形成［16－17］。 另 外，Albinsson等［18］研 究 也 指 出，在 动 脉 粥 样硬化患者中，内皮祖细胞生成的 miR－126、miR－130a、miR－221、miR－222和miR－92a等存在调节失控 。

1.2 miRNA与炎症炎症也是动脉粥样硬化发生、发展过程中一大重要病理基础。炎症可导致血管局部单核巨噬细胞浸润，促进脂质沉积，导致动脉粥样硬化脂纹等早期病变的产生。近年来研究表明，miRNA亦可通过调节炎症反应而参与到动脉粥样硬化过程中来。Zhu等［19］研究表明，miR－155通过炎症反应相关蛋白编码基因的转录后调控，调节冠状动脉粥样硬化的发生、发展。Nazari等［20］研究也证实，miR－155缺失的巨噬细胞中，细胞因子CCL表达减少，可促进单核细胞在粥样斑块的聚集。另外，miR－155可通过直接抑制BCL－6的表达，减弱炎症前因子NF－κB的信号传导。Nazari等观察到在BCL－6沉默的大鼠中，miR－155／巨噬细胞的沉着促进了动脉粥样硬化斑块的形成和CCL－2的表达，为miR－155调节动脉粥样硬化提供了有力证据。另外，Wu等［21］通过体内试验和细胞实验发现，miR－181a可通过调控c－Fos的表达，抑制DC中氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）触发的炎症反应，从而抑制冠状动脉粥样硬化的形成。

1.3 miRNA与单核巨噬细胞单核巨噬细胞通过促进炎症反应、脂质沉积和斑块破裂，在动脉粥样硬化发生与发展过程中发挥极其重要的作用。近年来研究表明，miRNA可通过对单核细胞的功能调节而发挥对动脉粥样硬化的调控作用。巨噬细胞集落刺激因子受体（c－Fms）参与了单核细胞分化成巨噬细胞的过程，在人单核细胞分化的巨噬细胞及动脉粥样硬化实验模型中，发现巨噬细胞集落刺因子能上调一些与胆固醇合成有关的基因及一些促进动脉粥样硬化的细胞因子。miR－124和miR－155已被确定在这一通路中发挥调控作用，研究发现，c－Fms为 miR－155的靶基因，miR－155通过调节c－Fms，抑制单核细胞向巨噬细胞分化，从而减少了巨噬细胞对纤维帽的降解，稳定了粥样硬化斑块［22］。巨噬细胞吞噬脂质，促进平滑肌细胞增生、纤维帽形成，故抑制其脂质吞噬能力或提高血浆高密度脂蛋白水平可以延缓动脉粥样硬化的进程。Rayner等［23］研究发现，给小鼠注入miR－33抑制剂后，三磷酸腺苷依赖的转录盒ABCA表达增强，血浆高密度脂蛋白升高，细胞胆固醇外排功能增强，抑制了动脉粥样斑块形成。最近，Rayner等［24］进一步以非洲绿猴作为研究对象，注入miR－33抑制剂，12周后也发现血浆中高密度脂蛋白持续升高，动脉粥样硬化的进程减慢，表明miR－33在脂质代谢及动脉粥样硬化方面有重要的调节作用。

2 miRNA与脑水肿

脑水肿既是缺血性脑卒中发展到一定阶段出现的病理生理改变，也是缺血性脑卒中的重要并发症。近年来一些研究表明，脑水肿的形成与一些因子的参与有密切的关系，如基质金属蛋白酶（MMPs）、水通道蛋白（AQP）等，而研究也证实，miRNA可参与调控这些因子的表达。

2.1 miRNA与基质金属蛋白基质金属蛋白（MMPs）通过降解细胞外基质（ECM），破坏ECM的完整性，使血脑屏障通透性增强而引起脑水肿。其中以基质金属蛋白酶－9（MMP9）与缺血性脑卒中后脑水肿关系最为密切。研究表明，MMP9是 miR－132和 miR－664的靶基因，这2个 miRNAs在急性脑缺血后表达降低，故使MMP9表达增高而促进脑水肿形成。Versican是组成细胞外基质的一种重要的硫酸软骨素蛋白聚糖，Wang等［25］研究表明，miR－143能够抑制versican mRNA的翻译，从而抑制ECM的合成，加重脑水肿。若能减少miR－143的表达，则有可能维持ECM的完整性，减轻脑水肿的产生。

2.2 miRNA与水通道蛋白水通道蛋白（AQP）是一种位于细胞膜上的蛋白质，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出。Sepramaniam等［26］研究提示，大脑组织中水通道蛋白1，4，9（AQP1，4，9）含量比较丰富，参与了血管源性脑水肿的形成。该研究指出，miR－320a通过下调AQP1和AQP4，减轻脑细胞内水的积累，从而起到减轻脑水肿、保护脑细胞的作用。同一时期，Lim等［27］研究也具有同样结果，他们以大脑中动脉闭塞后脑缺血水肿的大鼠为研究对象，发现miR－320a的表达明显下调，而此时AQP1和AQP4的表达则明显增高。AQP4是脑组织中含量最丰富的水通道蛋白，最 近，Sepramaniam 等［28］通 过 miRNA 检 测 软 件 （RegRNA 软 件 ），检 测 出 有 34 种 miRNAs（miR－130a，－152，－668，－939，－1280等）可与 AQP4的转录本（M1）上的启动子结合，并通过体内实验研究发现，抑制miR－130a的表达可显著增加脑组织中AQP4的含量，从而稳定水在脑细胞的进出，减轻脑水肿的发生。

3 miRNA与脑缺血再灌注损伤

缺血性脑卒中后脑组织血供中断，而尽早恢复血流再通，使缺血脑组织重新得到氧的供应，提供代谢所必需的营养物质并清除代谢产物，是治疗的主要目的及手段。然而缺血后的血流再通在某些情况下可导致进一步的组织损伤和功能障碍，这种恢复血流灌注后的有害情况称为缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）。IRI主要与氧自由基产生导致细胞毒性、细胞内钙超载破坏线粒体结构与功能、白细胞增多阻塞毛细血管及高能磷酸化合物缺乏影响能量代谢等因素有关。近年来，对脑缺血再灌注损伤的研究已深入到基因水平，miRNA作为一种重要的基因水平调控因子，对它的研究也相应越来越多。2008年，Jeyaseelan等［29］用基因芯片检测SD大鼠脑缺血1h，再灌注24h、48h血浆和脑组织中miRNA的表达。结果显示，再灌注24h后，血浆中miR－19b、－290、－292－5p表达升高，miR－103及 miR－107表达减少，而脑组织中则可检测出32种miRNAs表达发生变化。再灌注48h后，血浆及脑组织中分别又出现一组新的miRNAs，说明这些miRNAs可能与24h的急性脑缺血性损伤和48h脑缺血逐渐恢复这一病理生理过程有关。结果还显示，有10种miRNAs在再灌注24h、48h后，在血浆及脑组织中均表达且变化趋势一致，如miRNA－290在两个时段都升高，而let－7i表达均降低。这个实验还说明，miRNAs在缺血再灌注损伤后的表达存在时空特异性。这一点也被Ziu等研究小组证明，他们通过对胎鼠的大脑皮质初级神经元和星形胶质细胞在体外先给予氧糖剥夺处理60min，再将细胞移入正常氧糖培养基中而进行缺血再灌注处理，分别在不同时间点检测两种细胞的miRNAs表达，结果发现，神经元细胞中miR－29b在6h后上调2倍，24h后上调4倍，miR－21在24 h后上调2倍，而星形胶质细胞中miR－29b及miR－21仅在12h后才表现为上调，miR－30b、－107、－137在星形胶质细胞中表达出现改变，而在神经元细胞中却无变化［30］。Yin等［31］应用RT－PCR技术对大脑中动脉闭塞再灌注24h后小鼠大脑皮质miRNAs表达研究发现，miR－497表达较正常组织明显升高，同时，在体外对小鼠的N2A细胞进行缺氧缺糖处理，再检测该细胞的miRNAs表达，也发现miR－497表达较未进行缺氧缺糖处理的细胞增高4倍，说明体内或体外的缺血性刺激均可引起miR－497表达的增加。抗凋亡基因bc1－2／bc1－w是 miR－497的靶基因，脑缺血损伤后，miR－497表达增高，抑制了bc1－2／bc1－w的表达，从而促进脑细胞凋亡。经侧脑室灌注antagomir－497后，小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型大脑梗死灶面积减小。近年来国内也有学者在进行有关miRNA与脑缺血再灌注损伤方面的研究，同样用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，缺血1.5h，再灌注24 h后用基因芯片技术检测大鼠脑皮质中miRNAs表达谱的变化，发现包括 miR－27a、－32、－129、153等在内的9个 miRNAs表 达 上 调，而 包 括 miR－20a、－23b、－190、－191、－195、－320等在内的27个miRNAs表达下调［32］。

全世界人口缺血性脑卒中的发病率正在迅速上升，而目前对于该病的诊断仅限于临床症状及影像学检查，miRNA的发现为理解缺血性脑卒中的基因调控提供了全新视角。miRNA广泛参与缺血性脑卒中的发生、发展过程，如动脉粥样硬化、脑水肿、缺血再灌注损伤等方面。目前已有较多研究证明血清及血浆中均存在着稳定的miRNA［33－34］，也有研究证实，在脑缺血24h后的大鼠血浆中检测出脑组织特异性高表达的miR－124a表达明显增高［35］，故有可能通过对miRNA的进一步研究，使其成为缺血性脑卒中的血液标志物，协助早期诊断并有可能评估预后。Liu等［36］研究发现在大鼠局灶性脑缺血7d后，脑室管膜下区神经祖细胞中miR－124a的表达显著下降，而将 miR－24amimics（mir－124a的生物模拟物）导入缺血后的脑室管膜下区神经祖细胞中，可抑制脑缺血后神经祖细胞的增殖，促进神经细胞的分化，达到脑保护作用。故研究缺血性脑卒中的相关特异性miRNA，可能使其成为药物靶标，或模拟这一分子进行新药研发，可能会给人类缺血性脑卒中的治疗带来新的希望。然而，由于miRNA的数量庞大，每个miRNA的靶基因是什么，具体发挥怎样的功能，miRNA与靶基因mRNA错综复杂的交联关系，不同miRNA的组织特异性、时限性，以及相同miRNA在动物及人类中的表达差异性等一系列问题尚需要大量的研究与探讨，要想把miRNA分子充分用于人类疾病的诊断和治疗，目前的研究工作还只是冰山一角。

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