骨髓间充质干细胞应用于多发性硬化的基础及临床研究进展

郝飞 梁战华 李爱萍 于欢

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)炎性自身免疫性脱髓鞘疾病，多发生于青壮年，为欧美国家青壮年神经性致残的主要原因[1-2]。目前全世界约有2500万MS患者，给患者家庭及社会带来了沉重负担[2]。目前临床上MS治疗药物主要针对免疫系统，如糖皮质激素、免疫抑制剂和疾病修正药物如干扰素-β等。大量证据显示，MS患者致残的主要原因是永久性髓鞘脱失和大量轴突损伤，因此MS理想治疗应包括免疫调节和神经保护[3-4]。近年来研究发现，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)有较强免疫调节和神经保护作用[5-6]，在一定条件下还可转分化为神经元[5]，这已引起了科学家对BMSC在MS治疗中的极大兴趣。近5年研究发现，BMSC可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠临床症状，降低其临床评分，抑制CNS炎性反应，减轻髓鞘脱失和轴突丢失[7-8]。Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果显示，静脉或鞘内注射BMSC可以降低MS患者扩展的残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)评分，使临床症状改善或趋于稳定[9-11]。因此，本文就BMSC在MS的基础研究及临床应用作一综述，并进一步阐明BMSC作用的可能机制。

1 BMSC生物学特性及临床应用优点

BMSC是来源于骨髓的一种成体干细胞，数量约为骨髓内单核细胞总数的1/104～1/105，具有干细胞共有的自我更新及多向分化潜能，在一定条件下可向3个胚层细胞分化。BMSC高表达干细胞抗原CD90、CD29和CD73等，不表达造血细胞标记如CD34和CD45。近年来研究发现，BMSC中等程度表达MHCⅠ类分子，不表达MHCⅡ类分子和共刺激分子，具有低免疫原性[12]。将BMSC与T细胞共培养，BMSC不仅未活化T细胞，反而可抑制T细胞增殖，具有免疫调节特点[5]，这使BMSC成为了移植免疫和自身免疫性疾病中的研究热点。

与其他干细胞相比，BMSC应用于临床具有诸多优点[4]，如易从自体骨髓获得，体外易于大量扩增，自体回输无需应用免疫抑制剂，致畸性和致瘤性极低，不涉及伦理学问题等，且近期研究表明，BMSC在MS动物实验和临床试验中均显示出了一定的安全性和有效性，因此成为了MS干细胞治疗的种子细胞[1-2,4]。

2 BMSC在EAE中的保护作用及机制

2005年，Zappia等[5]将BMSC静脉移植给EAE小鼠，发现BMSC可抑制周围免疫器官病理性T、B细胞应答，使EAE症状改善。同年，Zhang等[6]也发现静脉注射人BMSC可促进EAE小鼠内源性少突胶质细胞和前体细胞(oligodendrocyte precursors，OPC)增殖，减轻炎性反应和脱髓鞘，促进小鼠神经功能恢复。之后陆续有文献从不同方面报道了BMSC在MS/EAE中的治疗作用，其可能作用机制主要包括免疫调节、神经保护和神经再生。

2.1免疫调节BMSC可诱导EAE小鼠T细胞对髓鞘抗原不应答，从而诱导周围免疫耐受[5]。Zappia等[5]在发病前、刚开始发病时和疾病高峰期分别给EAE小鼠静脉注射BMSC，发现其均可有效改善EAE小鼠症状，降低平均临床评分，减少脑内T细胞和巨噬细胞浸润，减轻髓鞘脱失。有研究者将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记的BMSC经静脉移植给EAE小鼠后1 d即可在脾和淋巴结被检测到，移植后40 d仍大量存在；从BMSC移植后40 d的EAE小鼠脾和淋巴结分离出T细胞，向其加入T细胞特异性髓鞘抗原或其他丝裂原如伴刀豆球蛋白A，发现其T细胞增殖被抑制，说明在疾病早期炎性反应阶段，经静脉移植的BMSC可迅速迁移至周围淋巴器官，诱导T细胞不应答和周围免疫耐受[5]。之后，Gerdoni等[13]在疾病开始时经静脉注射BMSC，发现不仅EAE小鼠症状明显改善，而且降低了EAE复发率，体内T细胞应答被抑制，脑内B细胞浸润和体内IgG分泌也减少；同时，BMSC也改善了过继转移实验中EAE小鼠症状，抑制了体内T细胞增殖[13]。BMSC对T细胞增殖的抑制包括细胞间的直接接触及其分泌的可溶性细胞因子，如肝细胞生长因子、前列腺素E2等[14-15]。

BMSC除可抑制T细胞增殖和B细胞免疫应答外，还可调节辅助性T细胞(helper T cells，Th cells)分化。目前认为MS/EAE的发病机制是Th1/Th2及Th17/调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)比例失衡的结果。Th1和Th17细胞可分泌促炎因子诱发炎性反应，Th2细胞可分泌抗炎因子抑制炎性反应，Treg亦是抑制性T细胞。有研究发现，BMSC可抑制EAE中Th细胞向Th1和Th17细胞分化，促进其向Th2和Treg细胞分化[16]。BMSC经静脉移植给EAE大鼠后，其外周血促炎因子如肿瘤坏死因子-α、γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-17等含量降低，抗炎因子IL-4和IL-10等含量增加。ELISPOT实验中，产生IFN-γ特异性的Th1细胞数量降低，产生IL-4特异性的Th2细胞数量增加[16]。BMSC对Th细胞分化的调节一方面是通过抑制树突状细胞成熟，另一方面是通过分泌转化生长因子-β和IL-6等细胞因子[17]。

2.2神经保护和神经再生BMSC治疗EAE的另一作用机制是神经保护和促进内源性神经再生，移植的BMSC在CNS炎性反应时可迁移至病变区，促进髓鞘修复，保护神经元和轴突。已有研究发现[5, 13]，EAE小鼠发病前经静脉移植BMSC，40 d时可在脊髓蛛网膜下腔检测到BMSC，少量位于软膜下实质炎性区，约占移植细胞总数的0.1%。在刚开始发病时经侧脑室注射BMSC，40 d时可在白质炎性区检测到BMSC，但当CNS无炎性反应时，BMSC不能穿过白质，仅围绕在侧脑室周围[8]，这表明CNS的慢性炎性反应不断募集BMSC，使其发挥局部免疫调节和神经保护作用。

BMSC可通过分泌脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)等促进OPC和神经干细胞增殖，从而促进髓鞘再生。进行BMSC移植的EAE小鼠脑内BDNF和NGF阳性细胞数明显增加[3, 6]，约50%～70% NGF阳性细胞与神经元标记共定位[3]。在刚开始发病时连续腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，14 d后BMSC组有5% BrdU阳性细胞与神经元-神经胶质2型抗原(NG2)阳性OPC共定位，BMSC约1%与受体相互作用蛋白(RIP)阳性少突胶质细胞共定位[6]，这表明BMSC促进了内源性OPC和少突胶质细胞增殖，促进了髓鞘再生。BMSC源性神经前体细胞(BMSC-NP)经鞘内移植给EAE小鼠，该小鼠病变区巢蛋白(nestin)阳性神经干细胞数增加，且不与BMSC-NP共定位，提示BMSC促进了内源性神经干细胞增殖[18]。此外，BMSC还促进了EAE小鼠体内神经干细胞向少突胶质细胞的分化，抑制其向星形胶质细胞的分化[16]。BMSC除可分泌神经营养因子外，还可分泌抗凋亡分子和抗氧化应激分子等减轻神经元凋亡和轴突损伤，发挥神经保护作用[19-20]。

2.3BMSC体内神经向分化尽管在不同因素诱导下的体外实验中，BMSC可转分化为神经元和神经胶质样细胞，但体内实验结果显示BMSC向神经元转分化能力有限。在EAE模型小鼠中，经静脉移植的BMSC虽可在脊髓软膜下炎性区被检测到，但其不表达神经元标记神经元特异性核抗原(NeuN)、少突胶质细胞标记少突胶质细胞表面标志物4(O4)和星形胶质细胞标记胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)[13]。将用CM-DiI(一种标记细胞膜的新型亲脂羧花青类活细胞荧光染料)标记的BMSC-NP鞘内注射给EAE小鼠，在第37、56和91天也未检测到CM-DiI阳性细胞与神经干细胞和星形胶质细胞标记共定位，提示BMSC在体内并未分化为神经元和胶质细胞[18]。相反，将人BMSC经静脉移植给EAE小鼠，第43天可在脊髓白质检测到不足1%的细胞表达神经干细胞和神经元标记[7]。Zhang等[6]也发现，经静脉移植给EAE小鼠的BMSC，第14天时有1%～2%与OPC标记共定位，第90天时有1%～5%与OPC标记共定位，这表明BMSC移植后有少量分化为神经细胞。尽管如此，这些结果也仅说明移植的BMSC可表达神经元表型蛋白，不能证实分化的BMSC具有神经元功能，并整合到了神经网络发挥作用，且不能排除细胞融合因素。因此，目前研究认为，BMSC体内转分化为神经元和少突胶质细胞替代病变细胞并不是BMSC治疗MS/EAE的主要机制。

3 BMSC在MS的临床应用

基于上述临床前期BMSC在MS动物实验治疗的有效性，小样本BMSC治疗MS的Ⅰ/Ⅱ期临床试验已陆续开展，这些临床试验初步证实了BMSC移植治疗MS的可行性、安全性和一定程度的有效性。研究表明，与从健康供者骨髓分离的BMSC相比，MS患者骨髓分离的BMSC在增殖能力、表型、分化能力和免疫调节能力等方面无明显差异[12]，且分离培养的BMSC在体外可扩增至移植所需量，经质控可达临床使用级别(包括核型、免疫表型、微生物检测、体外分化和免疫抑制能力检测)[21-22]，使BMSC自体移植治疗MS成为可能。MS患者接受经静脉或鞘内移植BMSC后，除可自行缓解或经治疗后缓解的轻微脑膜炎症状外，尚未见到其他明显不良反应[23]。Karussis等[23]将超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide，SPIO)标记的BMSC经鞘内联合静脉移植给15例MS患者，用MRI追踪标记的BMSC，发现移植后24～48 h即可在脊膜、神经根、脊髓实质和侧脑室后角检测到SPIO阳性BMSC，且其在移植后1～3个月仍存在。移植后4 h和24 h，MS患者外周血单个核细胞Treg比例增加，成熟树突状细胞比例下降，外周血T细胞对丝裂原植物血凝素刺激增殖能力下降[23]。随访至6个月时，15例患者的EDSS评分平均下降了0.8分，MRI上未发现新病灶或钆增强病灶，这提示移植的BMSC可迁移至CNS，通过免疫调节作用抑制炎性反应[23]。除免疫调节作用外，新近研究发现BMSC也具有神经保护作用[9]。将BMSC经静脉移植给10例MS患者，随访10个月时发现，这些患者的视觉诱发电位潜伏期缩短，波幅增强，视神经面积增加，提示BMSC可能促进了视神经髓鞘修复。另有研究表明，鞘内注射BMSC虽可使MS患者临床症状改善或趋于稳定，其MRI结果却显示疾病仍有进展，随访1年时MRI上病变数量增加，有新增病灶出现[10]，因此BMSC治疗MS的有效性仍需大样本随机对照双盲试验进一步证实。

BMSC在MS动物模型和临床试验中已初显成效，因此国际BMSC移植研究小组于2009年3月对BMSC移植治疗MS达成共识[21]，初步制定了BMSC移植的入选标准、排除标准、观察指标及BMSC培养流程、质控、移植量和移植途径等，使BMSC在MS的临床应用成为可能。

综上所述，BMSC对MS有一定治疗作用，其可能机制包括全身/局部免疫调节和神经保护作用，BMSC可表达大量黏附分子和趋化因子受体，当CNS病变时可归巢到CNS病变区发挥作用。尽管如此，BMSC移植仍有很多问题需要解决，如进一步确定BMSC临床使用的安全性、BMSC移植量、移植途径、移植时机、BMSC标记和示踪技术、移植BMSC最终结果及确切作用机制等。随上述问题的不断解决，BMSC移植很可能成为治疗MS的一种新方法，给MS患者带来新曙光。

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