植物源ACE抑制肽研究进展

郭显荣 ，黄卫文 ，b，龚吉军 ，b，王 挥 ，李忠海 ，b

(中南林业科技大学a.食品科学与工程学院；b.稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004)

高血压是一种常见的心血管疾病。我国有2亿人患有高血压，每年近150万人因高血压而死亡，这已成为严重的公共卫生问题之一[1]。现代医学研究结果表明，血管紧张素转化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)的高活性被认为是导致高血压的主要原因之一。ACE抑制肽具有抗氧化、降血脂、调节免疫、抑菌等功效，是治疗原发性高血压和心力衰竭的有效药物[2-3]。化学合成的 ACE 抑制剂如巯丙脯氨酸(Captopril)在达到降血压目的的同时往往伴有一定的副作用，如咳嗽、皮疹等[4]。从食物蛋白中水解得到的降血压肽具有人工合成的降压药物不可比拟的高安全性与零副作用的特点，如美国以三文鱼加工副产物为原料，水解所得降血压肽的降压效果良好。每天摄入1.5g该多肽就能使中等强度高血压患者的血压趋于平稳，用量少且效果好。来源于植物的ACE 抑制肽在降血压的过程中表现出明显的降压效果且无毒副作用，引起了人们的广泛关注[5-7]。

近年来学术界对于植物源ACE抑制肽的研究报道较多，国内外学者对ACE抑制肽在降血压的作用机理方面进行了深入的研究，在此基础上，以花生、玉米、菜籽、棉籽、米糠、油茶粕等为原料[8-12]，经酶解或发酵的手段获得了具有较好ACE抑制活性的多肽片段。但是，从不同植物中获取的ACE抑制肽的氨基酸序列有所差异，且提取的方式不尽相同，分离纯化也较为复杂，故ACE抑制肽在实际生产和应用中还存在许多问题[13]。因此，高效制备天然、安全、无毒副作用的 ACE 抑制肽已成为当前研究的热点。

1 ACE及ACE抑制肽(ACEI)的作用机理

ACE是一种含锌二肽羧基肽酶，其作用机理(如图1所示)主要表现在如下两个系统中：一是肾素-血管紧张系统(Renin-Angiotension System，RAS)，ACE将血管紧张素I(AngⅠ)转换为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，而AngⅡ可加强心肌的收缩力，使血压升高；二是激肽释放酶-激肽系统(Kalikkrein-Kinin System，KKS)，KKS为降压系统，其中舒缓激肽可增强毛细血管的通透性，使血压下降，而引起高血压的主要原因是ACE和舒缓激肽发生反应，使位于舒缓激肽C末端的二肽Phe-Arg缺失，成为失活片段。因此，抑制ACE的活性对于降血压有着积极的作用，而寻求ACE抑制剂也成为降血压研究中的热门话题。

图1 ACE对血压的调节及ACEI的作用机理Fig.1 Mechanisms of ACE regulating blood pressure and ACEI acting

ACEI活性强度主要取决于以下两个因素：一是肽段分子量；二是氨基酸组成。据Mullally等人[14]的研究结果，具有较高降血压效应的多肽片段的分子量大小主要集中在1kDa以下。至于氨基酸组成与降血压活性之间的关系，Cheung等人[15]研究的结论是，一般肽段含有的疏水性氨基酸越多，其ACE抑制活性越强。当C末端为芳香族氨基酸(如Phe、Tyr、Trp或Pro)，N末端为长链或含支链的疏水性氨基酸(如Leu、Ile、Val)时，其降血压活性相对较强，但若N末端含有Pro，则其降压活性反而降低。

2 ACEI的制备方法

2.1 酶 法

酶法主要是在温和的条件下采用蛋白酶催化水解植物蛋白生成具有降血压活性的多肽片段，该方法所需条件温和，原料来源广泛，安全性高，无毒副作用，是制备降血压肽的主要手段。碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃胰蛋白酶、胶原蛋白酶等是目前应用于制备降血压肽研究的主要酶类[16]。

刘 佳 等 人[17]采 用 Protease N、ProteaseS、Alcalase、Protamex、木瓜蛋白酶这五种蛋白酶分别对中性蛋白酶酶解后的大豆蛋白产物进行进一步的水解，以期制备更高活性的ACE抑制肽，其研究结果表明，Protease N是最合适的蛋白酶，即所获的大豆多肽的ACE抑制活性最高；其最优的制备条件为：底物浓度为5％，加酶量为2.0％，pH 值为7.0，温度为55℃。张晓平等人[18]以燕麦蛋白为原料，选用Neutrase、Protamex 和Alcalase三种蛋白酶分别进行单酶水解或自由组合的联合水解，其研究结果表明，单酶反应时，碱性蛋白酶为最适蛋白酶，水解产物燕麦多肽对ACE的抑制活性较强；而联合水解的优势并不明显。

2.2 发酵法

国内外的有关研究结果表明，发酵生产ACE抑制肽主要采用液态发酵方法，目前用于液体发酵的菌种主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉。刘显儒[19]分别采用上述菌种，以米糠为原料，进行了单一菌和复合菌液态发酵制备ACE抑制肽试验，结果表明，复合菌(枯草芽孢杆菌和黑曲霉)液态发酵所制得的米糠多肽对ACE的抑制活性最高，其最优的制备条件为：底物浓度5.0％，时间22h，温度34℃，接种比例为2∶1；ACE抑制率为70％。

将以酶法和发酵法制得的多肽片段进行进一步的分离纯化，以期得到降压效果最好的单一组分。目前应用于ACEI分离纯化的方法主要有超滤法、凝胶层析色谱法、离子交换层析、高效液相色谱、凝胶电泳等。在对肽段进行分离纯化时，一般会将分离原理不同的两种方法或手段结合起来使用，从而使分离的肽段更纯。Ma等人[20]将酶解后得到的荞麦多肽液进行分离纯化，首先采用Sephadex G-25阴离子交换层析法对荞麦多肽液进行初步分级分离，得到分子量大小不同的四种组分，分别测其ACE抑制活性，并用IC50(抑制50％ACE活性所用的ACE抑制肽的浓度)来表示，ACE活性抑制最强组分的抑制率为91％，IC50为25.7 μg/mL；然后采用反相高效液相色谱法对上述组分进行进一步的纯化，其中ACE活性抑制最强组分的抑制率为96％，IC50为6.3 μg/mL。倪莉等人[21]以可溶性素丝粉末为原料，直接用碱性蛋白酶水解，制备了具有较高ACE抑制活性的丝素肽，以质谱法检测到的其氨基酸组成为Gly-Tyr。但由于ACE抑制肽氨基酸组成的多样性，肽段长度不同，极性和疏水性也不尽相同，所以有针对性地设计纯化方案对于提高ACE抑制肽的纯度非常有效。

3 ACE抑制肽的分析检测方法

3.1 体外检测方法

目前体外检测方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳(HPCE)法这三种。

紫外分光光度法：Cushman和Cheung[22]于20世纪70年代建立了以紫外分光光度测定ACE抑制肽活性的方法。其基本原理是，在37℃、pH为8.3的条件下，利用ACE催化水解马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)生成马尿酸(Hip)，当加入ACE抑制肽时，催化水解反应被抑制，生成的马尿酸含量减少。由于马尿酸在紫外228nm处具有特征吸收峰，故可根据马尿酸吸收值的大小来衡量ACE的抑制活性。但是，该方法操作较为复杂，其中HHL在紫外228nm处也有一定的吸收峰，所以检测结果不够精确，易产生误差。

高效液相色谱法(HPLC)：2002年Wu等人[23]人改良了Cushman和Cheung的方法，采用高效液相色谱法检测ACE抑制活性。该方法利用RP-HPLC系统，采用梯度洗脱的方式，使得HHL和反应产生的马尿酸得到很好的分离，再进一步通过紫外检测器于228nm的波长下在线检测反应中马尿酸吸收值的大小。该方法快捷、简便，精确度高。 Danny等人[24]将电子质谱与液相色谱进行耦联，实现了降压肽抑制活性和组成的在线检测。

高效毛细管电泳(HPCE)法是一种新型的ACEI分析技术，其原理是以高压电场为驱动力，样品中各组分的离子或荷电粒子在毛细管中按其浓度和分配系数的差异进行高效快速的液相分级分离。2003年，辛志宏等人[25]在以麦胚蛋白为原料制备降血压肽的研究中，所得降血压肽活性较高。该法的优点在于釆用自动进样的方法，避免了人为误差，溶剂用量少，分析时间短。

此外，还可以采用薄层扫描法[26]和荧光分光光度法[27]进行体外检测。

3.2 体内检测方法

体内检测试验对于评价ACE抑制肽活性是不可或缺的。由于SHR的血压与人类血压相似，所以采用原发性高血压大白鼠(Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)建立的模型是研究降血压肽较好的动物模型[28]，其试验结果在一定范围内可以作为评价降血压肽生物学效应的参考依据。在一段时间内定期测量SHR的动脉收缩压，以此判定ACE抑制肽的降血压功效。降血压肽的摄入方法主要采用胃插管法和直接口服两种方式。摄入周期分为一次性检测和长期检测两种：一次性检测，主要检测SHR摄入降血压肽前后血压的变化情况，检测时间一般为2h；长期检测，以周或月为时间单位，几周或几个月连续摄入ACE抑制肽，同时以合成的降血压药物如卡托普利(Captopril)作为对照，观察收缩压的变化情况。

4 油茶粕ACE抑制肽的研究现状

油茶(Camellia Oleifera Abel)是世界四大木本食用油料树种之一，是我国所特有的经济林植物。主要分布在淮河-秦岭以南，北回归线以北，云南怒江流域、青藏高原以东，东南海岸、台湾以西。我国东部油茶种植区主要分布在海拔 800m以下的区域，而西部大多分布于海拔2 000m以上的区域[29]。近十年来，油茶的种植技术[30-31]、茶果成分及功能分析[32]、基因遗传学特性[33]等已成为我国经济林树种的研究热点。油茶粕即油茶榨完油所产生的副产物，经检测分析，油茶粕中含有大量的蛋白质、淀粉、茶皂素和粗纤维，其中蛋白质含量为12％～15％，是一种很好的蛋白饲料[34]。这种蛋白质由17种氨基酸组成，其中苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等 7种是人体必需的氨基酸。在温和的条件下，采用酶解法将油茶粕蛋白水解，可获得具有生物活性的多肽片段及游离氨基酸等物质，这些物质具有降血压、抗氧化、调节免疫力等功能。目前，研究制备油茶粕蛋白及多肽的报道相对较多，但有关酶解油茶粕蛋白制备降血压肽的研究，如对于适宜蛋白酶、特定酶解条件及多肽膜分离等关键技术的研究均处于试验探索阶段。

油茶粕蛋白的提取方法主要采用传统的碱提酸沉法，该方法操作简单，适用于工业化生产。于卫红等人[35]、孙英等人[36]分别采用纤维素酶预处理和超声预处理法来提高油茶粕蛋白的提取率，效果显著。对于油茶粕蛋白酶解制备ACE抑制肽，大多选用碱性蛋白酶。赵延华[37]以酶解后多肽液的ACE抑制率为指标，筛选出的最适酶为碱性蛋白酶，其最优的酶解条件为：pH为8.1，酶与底物之比为1.57％，温度50.5℃，时间6.66h。在此最佳条件下，油茶粕多肽的ACEI值为86.17％。丁丹华[38]采用中性蛋白酶酶解油茶粕蛋白制备ACE抑制肽，其ACEI为42％。龚吉军[39]采用响应面分析法对Alcalase酶解制备油茶粕多肽的条件进行了优化(ACEI达到84％)，并将分离纯化后的油茶粕多肽(MW＜3kDa)用于动物实验，结果表明，油茶粕多肽(MW＜3kDa)可有效降低SHR的SBP，即具有良好的体内降压作用。

本实验室采用碱提酸沉法从油茶粕中提取油茶粕蛋白[40]，经过蛋白酶的定向酶解，获得了具有一定ACE抑制活性的油茶肽；还从国外引进四种蛋白酶——Bacillus licheniformis、Aspergillus oryzae、Bacillus sp、Bacillus amyloliquefaciens 对油茶粕蛋白进行单酶水解和联合水解，结果表明，采用4％的Bacillus licheniformis水解效果最佳，其ACEI为52％。酶解液分别经3、5、10kDa的超滤膜进行分级分离，得到分子量小于3kDa的组分ACE，且其抑制率最强，为74％，然后采用凝胶过滤层析和HPLC再将此组分进一步分离纯化，冷冻干燥，得到了含量高、活性强的油茶粕ACE抑制肽。有关研究结果表明，油茶粕蛋白中富含Tyr、Pro、Phe和Leu等疏水性氨基酸，具有制备降血压多肽的功能成分[15]，所以酶法制备油茶粕ACE抑制肽是可行的。

5 展 望

21世纪是生物科技时代，寻求天然、健康的保健食品来调节人体机能的理念，已被广大消费者所认可和接受。植物源ACE抑制肽，是在温和条件下经过食品级蛋白酶的水解而制得的，其稳定性和安全性比合成药物高，且无毒副作用。长期服用不仅具有较好的降血压作用，还具有抗氧化、促进免疫及易消化吸收等功能。因此，植物源降血压肽具有良好的发展前景。

尽管目前国内外在研究ACE抑制肽的分离纯化方面较为复杂，投入和耗时都较多，仍有许多关键技术需要攻破，但随着科学研究的深入，蛋白酶、酶解及膜分离等关键技术的发展，食物源蛋白降血压活性肽制备技术将更加成熟。利用我国丰富的油茶粕蛋白资源，研制高活性降血压肽产品，实现油茶副产物的高效利用，将是植物源ACE抑制肽研究开发的重要内容之一。

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