陈赢男,张新叶,戴晓港
(南京林业大学 林木遗传与基因工程重点实验室,江苏 南京 210037)
油茶CamelliaL.是世界四大木本油料树种之一,也是我国最重要的木本油料经济作物,其寿命长,具有一次种植、多年受益的特点,稳定收获期可长达80 a以上[1]。近年来,我国南方大力发展油茶产业,全国现有油茶种植面积达到333万hm2[2]。在油茶产业蓬勃发展过程中,造林种苗是否为优良品种,与优良品种的选育一样,均是油茶林优质高产的基础。为确保油茶产业健康发展,急需建立一套真实、简便、快速、可靠的油茶品种遗传真实性鉴定技术,用于对油茶种苗生产的监督检查,对新品种的认定,以及对育种工作者知识产权的保护。
植物品种遗传真实性鉴定的关键是所依赖的技术手段。植物品种鉴别所采用的方法主要是依据植物的形态特征[3],但植物品种间在形态上的差异,特别是苗期的差异,往往并不十分显著。尤其是油茶这类世代周期长的物种,形态上的差异一般到了成熟期才能表现出来,大多数品种根本无法从幼苗的形态上进行鉴别。自20世纪80年代以来,现代分子标记技术的发展为植物新品种的鉴定提供了准确可靠的技术手段[4]。分子标记是以基因组DNA为基础的标记技术,是指能反映生物个体或种群间基因组差异的特征DNA片段,也称DNA指纹图谱。分子标记技术直接以植物基因组DNA为分析对象,从根本上克服了环境的影响,同时也不受基因表达调控的限制,在DNA水平上进行品种遗传真实性鉴定不但可靠性高,而且大大提高了检测效率。常见的分子标记有RFLP(restriction fragment length polymorphism,限制片段长度多态性)、RAPD(random ampli fi ed polymorphic DNA,随机扩增多态性)、AFLP(ampli fi ed fragment length polymorphism扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeat,简单重复序列或微卫星序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat,简单重复序列间隔)等[5-6]。通过DNA指纹技术鉴别生物个体已经成为一项成熟的技术,并在许多植物新品种鉴别中得到了广泛应用[4],该技术也成功应用于油茶的遗传多样性分析、种质资源鉴定等方面的研究[7-9]。
微卫星标记(SSR)是利用所研究物种自身的基因组序列开发而来,具有高度的特异性,同时微卫星序列又是基因组中变异速率最快的序列[10],微卫星标记具有高度的多态性。因此,在各标记类型中,微卫星标记是用于植物品种真实性鉴定的最为适宜的标记技术[11]。本研究中利用本实验室开发的油茶微卫星引物数据库,筛选出扩增谱带清晰,且多态性高的微卫星引物,并对这些引物用于油茶品种鉴定的实际效应进行了针对性试验,提供了一个油茶品种鉴定的操作实例。
试验所使用的油茶品种是通过南京林业大学南方林木种子检验中心联系南方几省区的林木种苗站获得,所收集的品种嫁接苗于南京林业大学温室中培养,摘取顶部幼嫩叶片用于基因组DNA提取。DNA提取方法参照Murray和Thomson的CTAB 法[12]。
微卫星引物选自Shi等[13]报道的油茶微卫星引物数据库(引物序列见ftp://202.119.210.10.)。根据微卫星引物扩增位点所含重复序列的长度,选取1 000对油茶微卫星引物由上海捷瑞生物技术有限公司进行了合成。生物信息学分析发现微卫星可分为2大类:长度不小于20bp的SSR为第1类,长度为12~20bp的为第2类[14]。与第2类SSR相比,第1类SSR具有更高的多态性[15]。这一规律是Weber最早于人类的微卫星试验数据中发现,并已在很多生物体中得到证实[16-17]。本研究中选取的油茶微卫星引物其扩增位点所含重复序列的长度均不小于20bp。利用合成的引物对浙江红花油茶和湘林1号的基因组DNA进行PCR扩增,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对这1 000对SSR引物进行初步筛选,首先筛选出有扩增产物的引物。PCR扩增反应在ABI-9700热循环仪上进行。PCR总反应体系为15μL,反应体系包括:模板DNA 25 ng,上、下游引物各20 ng(FAM标记),200μmol/L dNTP,0.5 U Taq聚合酶,1.5μL 10×buffer(含 100μmol/L Tris-HCl,pH 值8.3,500mmol/L KCl,20mmol/L MgCl2和 10g/L BSA),用无菌去离子水补充反应体积到15μL。PCR反应条件为:94℃预变性2min;然后94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,进行30个循环;循环结束后,72℃延伸5min。
随机挑选来自8个不同地点的油茶,提取基因组DNA,用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳对有扩增产物的引物进行多态性筛选。聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测的具体操作步骤如下:制备8%聚丙烯酰胺凝胶;室温下聚合2h后,将凝胶板固定于电泳槽上,用1×TBE冲洗胶孔,并在55℃保温箱中低压预电泳30min;取1μL PCR产物,按1∶9的比例与上样缓冲液(9μL去离子甲酰胺+1μL 10mg/mL溴酚兰)混合;94℃变性10min,结束后迅速置冰上冷却;点样,200 V恒压在55℃保温箱中电泳1h。电泳结束后,进行凝胶硝酸银染色,具体过程如下:将凝胶放入脱色盘中,用去离子水在脱色摇床上缓慢洗涤2min;将凝胶转入盛1%硝酸银溶液的脱色盘中,在脱色摇床上缓慢摇动,染色30min;用去离子水快速清洗凝胶2次后,转入盛显色液的脱色盘中,在脱色摇床上缓慢摇动,显色约10min,当凝胶上显出清晰的DNA条带时,取出凝胶用去离子水漂洗2次后,置灯箱上拍照。
对引物扩增位点的变异频率用多态信息含量(polymorphism information content,PIC)指数进行估算。
式中,CPI为某SSR引物扩增位点的多态信息含量;n为某SSR引物扩增的等位基因数;Pi为该位点第i个等位基因的频率[18]。
根据微卫星引物扩增位点的多态信息含量指数和聚丙烯凝胶电泳谱带筛选出电泳指纹清晰、基因型容易判定、多态性信息含量高的引物组合,应用于以下油茶品种的鉴别实例。
该鉴别实例目的是利用筛选出的油茶微卫星引物从送检材料中识别出目标品种。送检人员将样品编号,但编号与品种名称的对应顺序不告知检验人员。在送检的9份样品中只有1份为‘岑软3号’,其它样品为随机选取的不同品种。要在送检样品中鉴别出哪份为‘岑软3号’,并由送检人员确定检测结果是否准确。在试验过程中采用标准的‘岑软3号’为对照,为验证PCR反应的重复性,对照设置2个重复。利用筛选出的引物对包括对照在内的11份样品进行PCR扩增和检测。
微卫星引物扩增位点多态性筛选结果显示,不同引物扩增等位基因数为2~13个,PIC指数的变化范围在0.245~0.900之间,平均PIC指数为0.673。根据聚丙烯凝胶电泳谱带和引物扩增位点的PIC指数,选取10对电泳指纹清晰、基因型容易判定、多态性信息含量高的引物组合,用于油茶品种的遗传真实性鉴定。将这些组合分别命 名 为:NJFUC-601,NJFUC-53,NJFUC-57,NJFUC-251,NJFUC-833,NJFUC-600,NJFUC-787,NFJUCID-273,NJFUC-243,NJFUC-653。对应引物的PIC指数分别为:0.70,0.85,0.94,0.98,0.94,0.88,0.94,0.94,0.96,0.95。引物具体序列见表1。
表1 所筛选用于油茶品种遗传真实性鉴定的微卫星引物序列Table 1 SSR primers sequences used for identifying the authenticity of cultivars in Camellia L.
首先从表1所列引物中随机选用了引物NJFUC-243对送检样品进行了DNA指纹分析,产生的指纹见图1A。从结果可以看出,当利用引物NJFUC-243进行检测时,共有4份样品和对照基因型一致。图1A中泳道1、2为对照‘岑软3号’的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图,其它泳道为待检样品,其中泳道6、9、10、11的样品和对照‘岑软3号’的指纹图相同。利用该引物首先将候选样品缩减至4个。然后随机选取了第2对引物NJFUC-57进一步检测,产生的指纹见图1B,结果显示候选样品中只剩其中的1个样品(泳道6)和对照基因型一致。所以样品6号为‘岑软3号’,其它样品均排除为‘岑软3号’的可能。根据送检样品记录,检验结果与实际情况完全吻合。结果证实了筛选出的油茶品种微卫星引物在此类分析中的有效性。
图1 NJFUC-243(A)及NJFUC-57(B)在对照及送检样品中产生的指纹图Fig.1 Fingerprint map of submitted sample and control generated by NJFUC-243(A) and NJFUC-57(B)
应用分子标记对植物品种进行遗传真实性鉴定需要考虑以下因素:(1)简便、快速,易于在实际检验工作中推广使用;(2)标记针对待检物种有高度特异性,使检测结果不受内源和外源微生物或病原菌影响;(3)标记扩增基因位点多态性高,可以利用较少的引物组合达到较高的检测精度。考虑上述要求,微卫星标记是目前不同标记类型中,用于植物品种遗传真实性鉴定的可靠而又高效的标记技术。微卫星DNA也称简单重复序列,是由长度为1~6bp串联重复序列组成,微卫星是基因组中变异最为迅速的序列,其高度多态性主要来源于串联数目的不同[10]。微卫星标记是基于PCR扩增为基础的标记,微卫星标记分析相对于基于分子杂交为基础的标记要简便、快速得多[19]。同时微卫星引物是由待检物种的基因组序列开发而来,具有极高的种属特异性,这样即使样品中含有不同的内源和外源微生物或病原菌污染,检测结果也不会受到干扰。这一优点是RAPD或AFLP等这类随机标记所不具备的。
虽然微卫星标记具有上述优点,但在凝胶电泳中有些引物会产生“影子”谱带,影响结果判读,因此筛选能够产生清晰、稳定指纹图的引物,是利用该技术进行遗传鉴别的关键。在本研究中从大量引物中筛选出可应用于油茶遗传鉴别的引物。油茶不同品种间同一位点的SSR重复次数存在差异,造成了品种间等位位点的长度多态性。根据微卫星序列两端互补序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段,由于微卫星串联重复数目不同,通过扩增片段的电泳分离,可以分辨不同微卫星位点的等位基因。理论上,用1个引物对1个2倍体材料进行扩增时,最多能检测到2个等位基因,但从图1中看出,每个引物产生的指纹图大多超过2条谱带,产生这种现象的原因是大多数油茶为多倍体,其倍性变异在2倍体到8倍体之间[20-22]。指纹图上的谱带数与油茶品种的染色体倍性有关。
在本试验过程中,采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳,并给出了详细的试验程序,利用文中的方法,降低了实际检验中对仪器的要求,同时减少了检验成本,可以在普通实验室中推广应用。本文中的检测实例,利用的是已知样品进行验证性试验。因此,通过排除法使用少数即可实现目标。但送检样品未知时,如需确定品种的真实性,则需要进行大样本抽样,通过试验确定不同等位基因在群体中的频率。如果有了不同微卫星位点在群体中的等位基因频率信息,根据不同品种在不同微卫星位点上的等位基因频率,就可以估算出采用多个引物进行检测时,2个样本在多个位点上出现相同基因型的概率。这样就可以在实际检验中给出品种遗传真实性鉴定准确性的概率。
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