饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、血清生化指标和非特异性免疫指标的影响

■李 剑 刘淑兰 史庆超 翟少伟

（集美大学农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建厦门 361021）

水产养殖集约化程度越来越高,养殖产量提高的同时也出现了一些问题,如高密度养殖导致水体环境恶化加快,药物滥用导致鱼体免疫力下降,饲料营养搭配不当导致某些营养元素过量或不足等,这些刺激会引起机体应激反应[1]。过度应激会造成鱼体抗氧化功能降低、免疫功能抑制、氧化产物和皮质醇分泌增多,并使能量消耗过度,影响机体健康,导致疾病的发生[2-3]。近年来,植物多酚类物质作为饲料添加剂,缓解鱼类应激,促进鱼类生长和健康成为研究热点,如葡多酚可提高吉富罗非鱼的生长性能和肝胰脏抗氧化能力,调节血脂水平[4]；二氢杨梅素促进罗非鱼生长,提高罗非鱼免疫和抗氧化能力[5]；茶多酚能够提高虹鳟的生长和非特异性免疫能力[6]。槲皮素是近年来人们高度关注的一种多酚类化合物,存在于许多植物的花、叶、果实中,价格相对低廉,安全无毒[7]，具有极强的抗氧化活性,抗氧化能力可达VC的20倍[8]。研究发现：槲皮素可以有效缓解畜禽动物机体的氧化应激[9],降低血脂[10],保护内脏器官,增强免疫力,进而促进动物生长[11]。目前,关于槲皮素在鱼类饲料中的应用研究较少。为此,本试验以吉富罗非鱼幼鱼为研究对象,探讨饲料中添加不同水平槲皮素对其生长性能、血清生化指标以及非特异性免疫指标的影响,以期为槲皮素在鱼类饲料中的科学应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

饲养试验在集美大学水产学院综合楼生态室进行，试验用鱼由厦门鹭业罗非鱼良种场提供。试验鱼暂养驯化2周后，选取体格健壮、规格均一，平均体重为（11.50±0.05）g的吉富罗非鱼幼鱼240尾进行试验，试验分为4个处理组，每个处理组3个重复，每个重复20尾鱼，分别投喂在基础饲料中添加0(对照组)、200、400 mg/kg和800 mg/kg槲皮素（购于南京泽朗医药科技有限公司，有效含量为98%）的试验饲料。试验期为49 d。

1.2 试验日粮与饲养管理

根据罗非鱼的营养需要（SC/T 1025—2004）配制基础饲料[12]，饲料配方及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加0（对照组）、200、400 mg/kg和800 mg/kg槲皮素作为槲皮素组饲料。饲料原料粉碎过60目筛，原料混合均匀后，挤压成直径2.5 mm的颗粒，自然风干后，置于自封袋中，-20℃冷藏保存待用。

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

试验用鱼养殖于室内循环流水过滤水族箱（70 cm×50 cm×45 cm，加水量约为100 L）中。试验期间，每天8：30、13：00和18：00定时投喂，达到表观饱食，记录每缸饲料投喂量。投喂0.5 h后吸出残料和粪便，换水约30%。试验用水为曝气自来水，光照为自然光源，增氧机持续增氧。每天监测水质状况。试验期间水温23～28 ℃，pH值（7.2±0.3），溶氧浓度高于6.0 mg/l，氨氮浓度低于0.2 mg/l。

1.3 样品采集

养殖试验结束后，禁食24 h，每缸鱼全部称重，随机取6尾，用50 mg/l丁香酚进行麻醉处理，测量每尾鱼体重、体长，尾静脉取血，-4℃静置30 min后离心(5 000 r/min、15 min)取血清，保存于-80 ℃冰箱，用于测定血清生化指标和非特异性免疫指标。采血后的试验鱼解剖,分离出内脏团、肝脏、脾脏等,分别称重记录。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能指标

饲养试验结束后，根据测定的试验数据计算生长性能指标，计算公式如下：

增重率(WGR，%）=100×（Wt-W0）/W0；

特定生长率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t；

摄食率（FR，%）=100×Wd/[(W0+Wt)/2]/t；

饲料系数（FCR）=Wd/（Wt-W0）；

蛋白质效率（PER，%）=100×（Wt-W0）/Wp；

肥满度(CF，g/cm3）=100×Wb/L3；

脏体指数(VSI，%）=100×Wv/Wb；

肝体指数(HSI，%）=100×Wh/Wb；

存活率（SR，%）=100×Nf/Ni。

式中：Wt——终末体重（g）；W0——初始体重（g）；t——饲喂天数（d）；Wd——摄食饲料总重（g）；Wp——摄入蛋白质总量（g）；Wb——每尾鱼体重（g）；L——每尾鱼体长（cm）；Wv——内脏团重量（g）；Wh——肝脏重量（g）；Ni——初始鱼尾数；Nf——终末鱼尾数。

1.4.2 血清生化指标

采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血液尿素氮水平（blood urea nitrogen,BUN），谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）活性及甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）水平，具体测定方法参照操作说明书。

1.4.3 非特异性免疫指标

采用自身对照法测定血清溶菌酶(lysozyme，LZM)活性，磷酸苯二钠比色法测定酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性，均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。脾脏指数（spleen index，SI）即脾脏重量占鱼体重量的百分比。

1.5 数据统计与分析

试验数据均以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，数据由Excel 2010整理后，采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。若组间差异显著，再用Duncan's法进行多重比较，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响(见表2)

表2 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响

与对照组相比，饲料中添加槲皮素显著提高吉富罗非鱼幼鱼WGR、SGR、PER和CF（P＜0.05），FCR显著降低（P＜0.05）。200 mg/kg槲皮素组吉富罗非鱼幼鱼的WGR、SGR、PER和CF达到最大值，FCR达到最小值，但各槲皮素添加组间WGR、SGR、PER和CF均无显著差异（P＞0.05）。饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼FR、VSI、HSI和SR无显著影响（P＞0.05）。

2.2 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标的影响(见表3)

表3 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标的影响

随着饲料中槲皮素添加水平升高，吉富罗非鱼幼鱼血清中BUN水平，AST、ALT活性、TG和TC水平逐渐降低，且槲皮素组均显著低于对照组（P＜0.05）。各槲皮素添加组间BUN水平，AST、ALT活性和TC水平无显著差异（P＞0.05），400 mg/kg和800 mg/kg组TG水平显著低于200 mg/kg组（P＜0.05）。

2.3 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼非特异性免疫指标的影响（见表4)

表4 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼非特异性免疫指标的影响

饲料中添加槲皮素，吉富罗非鱼幼鱼血清中LZM和ACP活性显著升高（P＜0.05），但各槲皮素添加组间LZM和ACP活性差异不显著（P＞0.05）。槲皮素对罗非鱼幼鱼SI无显著影响（P＞0.05），但随槲皮素添加水平的升高呈现上升的趋势（P＜0.10）。

3 讨论

3.1 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼生长性能的影响

本试验结果显示，饲料中添加200～800 mg/kg槲皮素显著提高吉富罗非鱼幼鱼WGR、SGR和PER，显著降低其FCR，表明饲料中添加槲皮素能促进吉富罗非鱼幼鱼的生长，提高饲料利用率，以200 mg/kg槲皮素添加组效果最佳，综合考虑添加成本，建议在罗非鱼饲料中添加200 mg/kg槲皮素。研究表明：饲料中添加0.5%槲皮素显著提高牙鲆的WGR[13]；槲皮素类似物二氢杨梅素以2 400 mg/kg水平添加到饲料中显著提高罗非鱼的WGR和SGR[5]。本试验结果与以上报道类似，但本试验中添加200 mg/kg的槲皮素即可显著提高吉富罗非鱼幼鱼的WGR，添加量与他人研究结果有很大差异，可能是由于槲皮素的组分不同所致，更低剂量的槲皮素是否可以显著提高罗非鱼幼鱼的生长性能还有待进一步研究。CF、VSI和HSI是鱼类的形体指标，随鱼类的种类、生长阶段、饵料条件而变化[14]。在相同条件下，鱼类CF数值高通常表示生长状况良好，VSI可以反映鱼体可食部分的比例，HSI可以反映鱼体中储存能量的多少[15]。本试验条件下，槲皮素组吉富罗非鱼幼鱼的CF显著升高，表明槲皮素可以改善罗非鱼幼鱼的生长状况；槲皮素组HSI有所降低，可能是槲皮素促进肝脏脂肪分解，肝脏脂肪含量降低所致[16]。

3.2 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼血清生化指标的影响

血清生化指标和鱼类机体的新陈代谢和生理状况密切相关，可以反映出鱼体健康水平[17]。血清中的BUN是由氨基酸在肝脏中经过脱氨基作用产生的，与机体的蛋白质的利用效率密切相关[18]。AST和ALT大量存在于肝组织，当肝细胞受损时两者渗入血液，其在血清中的水平升高说明肝损伤恶化[19]。TG和TC是反映机体脂肪代谢的重要生理指标，其含量升高表明肝脏中脂肪堆积较多，容易引起脂肪肝、肝肥大等病理症状[20]。本试验结果显示，吉富罗非鱼幼鱼饲喂含槲皮素饲料49 d后血清BUN水平，AST、ALT活性，血清中TG和TC含量显著低于对照组，表明槲皮素提高了吉富罗非鱼幼鱼肝脏的健康状况，促进了肝脏对脂肪的分解利用。对大鼠[21]和穴兔[22]的研究表明，槲皮素能够显著降低应激状态下机体的BUN水平，AST、ALT活性。Shin等[13]研究发现，槲皮素能够降低牙鲆血清中TG的含量，其作用效果与槲皮素剂量和时间呈正相关。此外，在对大鼠[23]、东北民猪[24]、海赛蛋鸡[25]的研究中也表明槲皮素可以降低血清中TG水平，这可能与槲皮素调节环磷酸腺苷信号通路，降低脂肪细胞内脂肪合成代谢酶含量，抑制脂肪合成，从而降低细胞内TG含量有关[26]。

3.3 饲料中添加槲皮素对吉富罗非鱼幼鱼血清非特异性免疫指标的影响

血清LZM和ACP活性可以反映水生动物非特异性免疫力的高低，它们是单核巨噬细胞的分泌酶，在机体非特异免疫防御中发挥着重要作用[27]。免疫器官指数也可以反映机体免疫能力的高低，鱼类的免疫器官主要是指脾脏和头肾，一般认为其重量增加是免疫增强的表现[28]。本研究中，吉富罗非鱼幼鱼摄入槲皮素后血清LZM和ACP活性显著升高，SI随槲皮素添加水平呈上升趋势，表明槲皮素增强了罗非鱼幼鱼非特异性免疫能力，并在一定程度上提高了免疫器官指数。研究表明，槲皮素可以显著提高牙鲆血清LZM活性和ACP活性，具有提高SI的作用[29]。槲皮素对罗非鱼幼鱼非特异性免疫能力的增强作用可能与其抗氧化作用有关[30]。吞噬细胞在呼吸爆发过程中产生自由基，在清除异物或杀伤细菌的同时，也会对周围的免疫细胞产生损伤。槲皮素可以清除自由基或与铁离子发生螯合作用缓解腹腔巨噬细胞的氧化应激[31]。本研究中，随着槲皮素添加水平的升高，LZM活性呈现出先升高后降低的趋势，其原因可能是高浓度的槲皮素与LZM结合，LZM构象发生改变[32]，进而使LZM的活性降低。

4 结论

饲料中添加适宜水平的槲皮素可提高吉富罗非鱼幼鱼生长性能，改善血清生化指标，增强非特异性免疫力，在本试验条件下，建议吉富罗非鱼幼鱼饲料中添加200 mg/kg槲皮素为宜。