结直肠癌组织中血管紧张素转换酶基因多态性临床研究

侯安继，高红芳，胡 艳，赵德民，茅佩娟

(1.上海市第七人民医院肿瘤科，上海200137;2.上海市第七人民医院外科，上海200137;3.上海市第七人民医院心内科，上海200137)

血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)基因多态性由DD 型、ID 型和II 型等3 种基因型组成，分为D 等位基因和I 等位基因。长期以来，人们认识到血管紧张素(angiotensin，Ang)水平在个体中稳定，在个体间或不同人种间差异显著，近来的研究证实这种差异与ACE 基因多态性相关［1］。ACE基因多态性分布可能与结肠癌发病存在一定关系，但所得结论有待进一步验证［2］。

近年来，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率持续上升，除了已知的遗传因素外，是否与膳食结构改变、生活方式变化等因素有关值得关注。此外，作为调控血压和血管生成的重要基因，ACE 基因多态性与肿瘤关系的研究日益受到重视，不同研究者对多种肿瘤与ACE 基因多态性的关系进行了研究，大多研究［3-6］认为ACE 基因多态性与肿瘤之间存在一定的相关性，应用ACE 抑制剂也能降低肿瘤发病率，但也有研究不支持该结论，说明ACE 基因多态性与肿瘤的关系尚未弄清;ACE 基因与CRC 的关系亦是如此，说明ACE 基因多态性与CRC 的关系值得进行深入的基础与临床研究。

本文在研究外周血ACE 基因多态性基础上，研究结直肠癌组织和癌旁组织标本中ACE 基因多态性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准:1)临床确诊为CRC，接受手术治疗且资料完整者;2)所有病例须取得病理学诊断;3)年龄20 ～79 岁，预计生存期在3 个月以上，PS 评分≤2 分;4)入组前4 周内，未接受过放、化疗者。排除标准:1)未取得病理诊断者;2)年龄不符;3)原发性高血压病患者;4)两端切缘有一端阳性者;5)不愿意接受本研究措施或随访不便者。

1.2 一般资料 选择我院普外科2011年1月至2012年12月手术的CRC 患者30 例，年龄25 ～79 岁，中位年龄为61.5 岁;男17 例，女13 例;结肠癌25 例，直肠癌5 例;临床分期:I～Ⅱ期者14 例，Ⅲ～Ⅳ期者16例。所有切除的新鲜肿瘤组织经标记后置于液氮罐中保存备用，部分肿瘤组织和两端切缘进行常规石蜡包埋，供病理切片诊断，结肠中分化腺癌8 例，结肠乳头状腺癌3 例，结肠黏膜浸润性腺癌3 例，结肠中低分化腺癌5 例，结肠黏液腺癌2 例，结肠管状腺癌1 例，结肠印戒细胞癌1 例，直肠中分化腺癌5 例，直肠管状腺癌2 例。

1.3 DNA 的提取、引物的合成及PCR 扩增 采用蛋白酶K 消化酚- 氯仿抽提法提取DNA。ACE-I和ACE-Ⅱ引物委托上海生工合成，引物序列参考文献［7］，引物1 为ACE-I，其扩增片段大小:插入型为597 bp，缺失型为319 bp。PCR 扩增体系总体积25 μL，反应 体 系 包 括Taq 酶1. 0 μL，10 × buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1，dNTP 和引物(10 pmol·μL-1)各0.5 μL，模板gDNA 约100 ng。PCR 的扩增条件:先予94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，再56 ℃45 s，及72 ℃1 min，总共35 个循环，最后步骤为72 ℃5 min;引物2 为ACE-Ⅱ，反应条件同ACE-I，退火温度为65 ℃，扩增片段大小为335 bp。对于DD 型标本进行再扩增验证，若扩增出目的片段则该标本实际为ID 型。ACE-I:upper:5’-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3’;down:5’-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3’。ACE-Ⅱ:upper:5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3’;down:5’-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3’。

1.4 PCR 产物检测 经前述实验过程所得到的PCR产物采用质量分数1. 5%琼脂糖凝胶电泳，共需30 min，所使用的Marker 为DL2000，所用电压为100 v，电泳结束后在紫外灯下观察条带。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 基因亚型特点 经ACE-I扩增后，3 种亚型的特点为:DD 型见319 bp 片段条带，II 型为579 bp 条带，ID 型则可见上述2 种片段的条带。为防止DD 型优势错配影响结果，对ACE-I扩增后为DD 型标本采用ACE-Ⅱ进行验证，若能扩增出335 bp 条带则为ID 型。

2.2 ACE 基因型检测结果 CRC 组织中II 型、ID型、DD 型分布频率分别为16. 67%、43. 33%、40.00%，癌旁正常组织3 种基因型分布频率分别为30.00%、53.33%、16.67%，构成比比较差异有统计学意义(χ2=3.857，P ＜0.05)。

2.3 等位基因检测结果 CRC 组织中I 等位基因和D 等位基因分布频率分别为38.33%、61.67%，癌旁正常组织分别为56.67%、43.33%，以癌旁正常组织为参照，CRC 组织的OR 值为1. 423，95% CI 值为1.001 ～2. 002，两者比较差异有统计学意义(χ2=4.043，P ＜0.05)。

3 讨论

近30年来，随着经济高速发展，我国CRC 发病率也持续上升，特别是在城市人口中，CRC 发病率和死亡率均占到肿瘤发病率的前3 位［8］，这一情况与发达国家类似。很多患者确诊时已失去手术根治机会，化疗和靶向治疗是主要的治疗手段，因此，如何提高早期诊断率具有重要意义，其中，寻找和发现新的诊断和治疗靶点可能是一条有效的捷径，而对ACE 基因的深入研究也正契合这一方向。

近些年来，ACE 基因多态性与恶性肿瘤关系的研究日渐增多并取得很多成果。如非小细胞肺癌患者易患贫血与ACE 基因多态性有关;ACE 基因中D 等位基因异常表达可能与口腔癌发病有关;乳腺癌患者D等位基因表达异常增高;胃癌发病与ACE 基因多态性相关等。上述瘤种和ACE 基因多态性存在不同程度的关联，大部分研究［9-11］认为，多种肿瘤发生或分化程度和ACE 基因多态性相关，尤其与D 等位基因高表达相关联，其机理可能与ACE 基因活性增高，导致Ang Ⅱ水平增高，血管内皮生长因子表达上调，促进肿瘤血管生成、影响肿瘤侵袭能力或分化程度等关系密切，从而影响肿瘤生长和预后。

CRC 与ACE 基因多态性的关系近年来研究也较多，有一项研究［12］纳入了241 例CRC 患者，通过对外周血中ACE 基因多态性检测，发现D 等位基因携带者可能预后不良，但也有学者［13］进行同类研究并未得出相同结论，这种矛盾的状况说明ACE 基因多态性与CRC 的关系是复杂的，可能与人种差异等多因素相关。本课题组前期研究［2］报道人群中II 型纯合子表达的增多与结肠癌发病相关，但I/D 等位基因与正常人比较无显著差异。本研究中，我们对30 例CRC 患者肿瘤组织与癌旁正常组织ACE 基因多态性进行研究，结果发现，肿瘤组织ACE 基因多态性中，DD 型基因型增多者易患CRC，对等位基因分析表明，D 等位基因占优势的人群可能为结直肠癌的易患因素之一。

综上所述，本研究结果是对CRC 肿瘤组织和癌旁正常组织的检测结果，与前期外周血研究结果比较，有一定的新发现，如检测肿瘤组织ACE 基因多态性对肿瘤的预测意义较外周血可能更有意义，同时也证实了外周血ACE 多态性研究结果，即D 等位基因与CRC发病相关，我们的研究与部分国内外研究者的研究结论类似，初步说明ACE 基因多态性与CRC 发病有关，提示关注ACE 基因DD 基因型和D 等位基因可能对CRC 的诊断和预后提供有益信息，ACE 基因是否可能成为CRC 治疗的新靶点值得进行更深入的研究。

［1］Doerner M，Beckmann K，Knappertz V，et al.Effects of Inhibitors of the Renin-Angiotensin System on the Efficacy of Interferon beta-1b:A post hoc Analysis of the BEYOND Study［J］. Eur Neurol，2014，71(3/4):173 -179.

［2］胡艳，侯安继，张红卫，等. 结肠癌患者肿瘤组织中血管紧张素转换酶的基因多态性研究［J］.肿瘤，2010，30(3):265 -266.

［3］Zhang Y，He J，Deng Y，et al.The insertion/deletion (I/D)polymorphism in the Angiotensin-converting enzyme gene and cancer risk:a meta-analysis［J］.BMC Med Genet，2011，12:159.

［4］Liu SY，Sima X，Wang CH，et al.The association between ACE polymorphism and risk of colorectal cancer in a Chinese population［J］.Clin Biochem，2011，44(14/15):1223 -1226.

［5］包怀鸣，陈志荣.血清肝细胞生长因子水平与结肠癌关系的研究［J］.肿瘤基础与临床，2012，25(2):111 -113.

［6］Chiang YY，Chen KB，Tsai TH，et al.Lowered cancer risk with ace inhibitors/ARBs:a population-based cohort study［J］. J Clin Hypertens (Greenwich)，2014，16(1):27 -33.

［7］林源，郑颂国，陆孝禹，等.甲醛固定及石蜡包埋组织的DNA 分型及其应用［J］.法医学杂志，1999，15(2):82 -83.

［8］万德森.结直肠癌流行病学与预防［J］.中国中西医结合外科杂志，2011，17(1):3 -7.

［9］Namazi S，Daneshian A，Mohammadianpanah M，et al. The impact of renin-angiotensin system，angiotensinIconverting enzyme (insertion/deletion)，and angiotensin Ⅱtype 1 receptor (A1166C)polymorphisms on breast cancer survival in Iran［J］. Gene，2013，532(1):125 -131.

［10］Vairaktaris E，Yapijakis C，Tsigris C，et al.Association of angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism with increased risk for oral cancer［J］. Acta Oncol，2007，46(8):1097-1102.

［11］van der Knaap R，Siemes C，Coebergh JW，et al.Renin-angiotensin system inhibitors，angiotensin I-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism，andcancer:the Rotterdam Study［J］. Cancer，2008，112(4):748 -757.

［12］Liu SY，Sima X，Wang CH，et al.The association between ACE polymorphism and risk of colorectal cancer in a Chinese population［J］.Clin Biochem，2011，44(14 -15):1223 -1226.

［13］Nikiteas N，Tsigris C，Chatzitheofylaktou A，et al. No association with risk for colorectal cancer of the insertion/deletion polymorphism which affects levels of angiotensin-converting enzyme［J］.In Vivo，2007，21(6):1065 -1068.