我国结核病实验室诊断进展历程

宋媛媛 郑惠文 赵雁林

结核病是一种古老的疾病，在人类历史上肆虐了数千年，已经造成包括雪莱、契诃夫和诸葛亮等在内的数以千万计甚至是无以计数的人死亡，一度曾被称为“白色瘟疫”。从伏曦画八卦，制九针。神农尝百草，始有医药。黄帝教民治百病，埃及、希腊神话，荷马史诗等中的医学史里可以看到，人类一直在同疾病做斗争，人类的医学史也是人类同疾病做斗争的历史，在业内人士的共同努力下，结核病实验室诊断技术也伴随着人类抗击结核病工作的全面展开和深入而不断发展和涌现。

实验室诊断是结核病诊断、治疗及预防控制过程中所必需的。结核病实验室检查是发现传染源的最主要手段，是确诊结核病和选择治疗方案的主要依据，也是考核疗效、评价防治效果的可靠标准。结核病实验室工作是全国结核病防治规划(NTP)的重要组成部分，在结核病防治工作中起着不可缺少的重要作用。笔者就我国结核病实验室诊断技术的发展历程和应用阐述如下。

结核病实验室网络的建立

解放初期，我国主要通过建立结核病疗养院和传染病医院等来收治结核病患者，我国于1981年建立了结核病登记报告制度；1991年和1992年相继开展世界银行贷款结核病控制项目和中央加强与促进结核病项目，标志着我国开始开展系统的结核病防治工作，当时的实验室诊断技术主要以涂片为主，随着结核病防治项目的不断扩展，涂片检查实验室(痰检室)逐步在国内建立，1994年开始创建痰涂片质量控制系统，到2000年已初步具备全国实验室网络规模，质控覆盖面和力度逐年增加[1]。

2001—2004年，全国结核病防治机构已逐步建立了独立的结核病实验室，我国进一步健全了“国家级参比实验室→省级参比实验室→地(市)级实验室→县级实验室”四级结核病细菌学实验室网络。2004年制定《中国结核病防治规划——痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，并快速覆盖到各级实验室。2004年前国家卫生部统一部署在全国1/3的乡镇卫生院设立了痰涂片检查点，至2005年底共设立了9520个乡镇查痰点；从2008年起，我国开展培养、药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和分子生物学诊断的结核病实验室逐年增多，根据《全国结核病防治规划(2011—2015年)》的要求，到2015年底，将有80%县级结核病实验室具备开展分枝杆菌培养的能力，100%的地市级结核病实验室具备药敏试验的能力，100%的省级结核病实验室具备开展快速菌种鉴定的能力；我国结核病实验室网络工作模式主要是国家级、省级、地(市)级实验室分别负责对其下级实验室进行质量控制、技术指导和培训等技术管理工作。

结核分枝杆菌培养和药敏试验

新中国成立后的很长一段时期，在我国，以影像学检查作为发现结核病的主要手段，1951年孟昭赫撰写了《结核病细菌学诊断法》，以1953年林建撰文详细描述Mtb的细菌学检查为标志，我国开始使用集菌涂片法和痰分枝杆菌培养方法；1955年朱贵卿等引进并改良了玻片培养法，郑志平等用谷氨酸钠替代天门冬酰胺制备分离培养基，随后该培养基成为我国临床分离培养的主导培养基一直沿用至今。1993年我国开始引入液体培养BACTEC TB 460快速检测系统，该方法采用放射性核素技术对细菌在生长过程中产生的具有放射性的代谢产物14CO2含量进行监测，但因该底物有放射性，易污染环境，我国于1998年停止了该设备的使用；同年在我国引入MGIT 960系统即分枝杆菌生长指示管(mycobacteria growth indicator tube，MGIT) 960系统，该方法是集分枝杆菌快速生长培养、检测及药敏试验技术为一体的全自动分枝杆菌培养系统，解决了BACTEC TB 460存在的放射性污染问题，并保留了其快速的优点，使结核病细菌学检查方法有了进一步发展。1995年，国家结核病参比实验室与WHO积极合作，组织开展全国耐药监测项目，自此引入了比例法药敏试验，我国开始了绝对浓度法和比例法药敏试验的并用时代。

目前，常用的自动化液体培养系统主要有3种：(1) BACTEC MGIT 960自动化培养系统，通过检测液体培养基中消耗氧气的量来确定是否有细菌生长，MGIT培养管底部的硅树脂中含有氧淬灭荧光剂，当细菌生长过程中吸收散布在培养管中的氧气，排放出CO2，随着管中氧气的逐渐损耗，荧光剂不再被抑制，当使用紫外线(ultra-violet ray，UV)进行观察时，MGIT培养管便会发出荧光，其荧光强度直接与氧气的消耗呈正相关，对于Mtb来说，在阳性情况下，每毫升培养基中大约有105～106个菌落形成单位(CFU)，如果6周(42 d)之后，该仪器仍为阴性，则表示培养管为阴性[2-7]；(2)BacT/ALERT 3D培养系统，通过连续检测接种标本的培养瓶中CO2水平及其变化判断是否有分枝杆菌生长，培养瓶底部含有颜色感应器，此系统用一个比色计传感器和反射光监测溶解于培养基内的CO2的存在和生成，当培养瓶中有微生物生长将产生CO2，导致培养基的pH 值改变，传感器颜色从蓝绿色变为黄色，仪器每10 min自动连续地检测，如有颜色改变将自动报警[8]；(3)Versa TREK/ESP全自动快速血培养系统，通过自动监视培养基瓶子顶部的氧气消耗量来查看Mtb的生长，仪器通过压力感应器感应培养瓶内的压力变化，从而判断是否有细菌生长。

分子诊断方法

20世纪90年代初，国内众多实验室开始使用聚合酶链反应(PCR)技术，至1997年由于污染防控措施不到位，曾经一度在结核病的实验室辅助诊断中停止使用；之后，经过加强质量管理等措施又逐步应用到临床检测中。21世纪初始，随着分子生物学技术的不断发展，新型分子诊断技术大量涌现，因其通常具有较高的敏感度、特异度而日益显示其优越性，近年来在我国食品药品监督管理总局获批准注册的分枝杆菌快速分子诊断技术主要有：实时荧光定量聚合酶链式反应法、核酸探针技术、基因芯片(genechip)技术、环介导等温扩增技术、交叉引物扩增技术(crossing priming amplification, CPA)和熔解曲线等检测技术产品。

实时荧光PCR熔解曲线法，是建立在野生型DNA分子和突变型DNA分子的GC含量不同的基础之上，在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增处与探针序列互补的单链核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)，根据推断该序列突变信息，从而检测Mtb是否对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇和氟喹诺酮类等药物耐药，我国正在对其可靠性和可行性进行多中心临床评估[9-10]。

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸阵列，是指采用原位合成(或显微打印手段)，将DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。基因芯片对结核病的耐药检测基于Mtb针对不同药物的基因突变位点不同，各突变位点与耐药性有一定的相关性，通过检测突变位点的DNA片段，来判定Mtb是否对利福平和异烟肼耐药[11-12]，该方法经过多中心评估，已经在我国一些地区推广应用。

线性探针技术通过将PCR扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体，通过引物扩增目的片段，扩增产物与膜上固定的特异性探针杂交，杂交物通过酶显色反应判断结果。线性探针检测Mtb耐药基于Mtb针对不同药物的基因突变位点不同，各突变位点与耐药性有一定的相关性，通过检测出突变位点的DNA片段，来判定Mtb是否对利福平和异烟肼耐药[13-14]，该方法经过多中心评估，已经在一些地区推广应用。

CPA是一种新的核酸恒温扩增技术。CPA与其他技术相结合(如快速核酸提取技术、核酸试纸条检测技术等)，除包含具有链置换功能的Bst DNA聚合酶外，还主要包括扩增引物和两条交叉引物。这些寡聚核苷酸链能依靠嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使DNA的循环扩增能不断的实现，从而确定受检样本中是否有Mtb的存在[15-16]。多中心临床验证显示，其敏感度和特异度与传统培养方法相近[17]。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simulta-neous amplification test，SAT)是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术，在同一温度下，首先通过莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，M-MLV)反转录酶产生靶标核酸(RNA)的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(100～1000个)RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况[18-19]。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是针对靶基因序列的不同区域设计几种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65 ℃左右)即可完成核酸扩增反应的特点，对Mtb目的DNA片段进行检测从而获得结核病信息的方法[20-21]。

半巢式全自动实时荧光定量PCR检测系统(Xpert Mtb/RIF)是一种半巢式实时荧光PCR体外诊断技术，可对Mtb及其对利福平耐药性进行检测，该技术针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否罹患结核病及是否对利福平耐药(rpoB序列存在突变)，该方法整合了基于定量PCR 分子遗传检测所需的3个步骤(样品准备、扩增、检测)，将待检样品放入到Xpert的反应盒中，系统将会自动按照相应的程序运行，实时监测PCR进行情况[22-24]。该方法经过多中心评估，已经在我国一些地区使用。

荧光定量PCR是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化、并通过循环阈值(Ct值)和标准曲线的分析对起始模板进行定量检测的方法。该方法实现了对PCR指数增长期的闭管信号检测，不但检测敏感度高、污染概率小，且可对初始模板进行相对或绝对的定量，避免了传统PCR主要针对线性增长期或平台期检测的种种缺陷。依据检测方式的不同，荧光定量PCR可大体分为熔解曲线分析和荧光化学检测两种，在Mtb检测试剂盒中常见的TaqMan探针、分子信标和杂交双探针等均属于后者。荧光定量PCR检测的靶序列通常为16S rDNA、16S rRNA和23S rRNA间的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)，仅存在于结核分枝杆菌复合群(MtbC)的插入序列IS6110，以及相对分子质量为65 000的热休克蛋白基因、recA基因、sodA基因、hsp65基因和rpoB基因等，主要检测MtbC的存在与否。由于目前认为MtbC由Mtb、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、肯尼迪分枝杆菌(M.canettii)、山羊分枝杆菌(M.caprae)和pinnipedii分枝杆菌7种菌种组成，我国除Mtb和牛分枝杆菌外其余菌种较罕见，而MtbC各成员间的DNA序列高度相似，具有共同的核心基因组，较难加以区分，故在临床检测中一般仅检测MtbC存在与否即可。进一步的鉴定可检测pncA和oxyR基因的突变、PCR扩增缺失区(region of deletion，RD)或mpt40-PCR等，可部分区分MtbC菌种。而综合23S rDNA、gyrB基因和RD1侧翼区域的检测结果可鉴定大部分MtbC菌种，少数菌种需要全基因组序列分析方可区分[25-26]。

免疫学诊断技术

1890年Robert Koch制备了旧结核菌素，开创了结核病免疫学诊断的先河。1953年我国张学德等评估了敏感红细胞凝集试验；“文革”之后直到1980年，酶联免疫试验和单克隆技术逐步在我国建立和使用，目前常用的检测方法主要有酶联免疫吸附试验、斑点免疫渗滤试验、斑点免疫层析试验、免疫印迹试验、细胞因子检测和蛋白芯片技术等。

2003年起，我国各级实验室陆续开始应用γ干扰素(IFN-γ)释放试验来确定结核潜伏感染(LTBI)者及结核病的辅助诊断。其中常用的方法有两种。(1)基于全血的酶联免疫吸附试验。通过应用Mtb特异性蛋白质的多肽抗原[这些蛋白质是早期分泌性抗原靶6 (ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)和TB7.7]与全血共孵育，由于BCG菌株及绝大部分的非结核分枝杆菌(M.kansasii、M.szulgai及M.marrinums除外)都不含有这3种蛋白质，它们能够刺激感染Mtb者的T细胞产生IFN-γ的反应，但在未感染者、或接种卡介苗但无结核病或LTBI风险者，则不会产生反应，利用酶联免疫实验检测并定量分析IFN-γ的浓度，判断是否存在Mtb特异性细胞免疫反应[27-28]。(2)基于外周血淋巴细胞的免疫斑点试验。通过将外周血淋巴细胞、Mtb特异的混合抗原A和B(分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片段)，与对照试剂一起加入预先包被抗IFN-γ抗体的微孔培养板进行培养。当外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中存在对Mtb的特异T细胞时，培养液中加入的Mtb特异混合抗原A和B时将刺激其分泌IFN-γ。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ抗体捕获，再次加入碱性磷酸酶标记并针对不同IFN-γ表位的二抗与被捕获IFN-γ结合，滞留在微孔板表面，显色底物在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每个斑点代表1个Mtb特异的效应T细胞。根据斑点数可以推测体内是否存在对Mtb反应的效应T细胞[29]。

从全球来看，结核病的高负担国家主要集中在发展中国家。由于经济发展程度所限，已经被使用了百余年的痰涂片显微镜检查技术和分离培养技术仍然是发展中国家结核病实验室诊断体系中所采用的主要方法。我国是发展中国家，结核病控制系统中目前奉行着以细菌学检查作为发现传染源和疗效评定的主要手段，逐步推广和应用新型实验室诊断技术的态势。目前，我国的结核病实验室网络中，已经有1/3的县(区)至少有一家结核病实验室配备了快速分子诊断技术；全国2/3的地(市)级中至少有一家结核病实验室装备了快速进行Mtb耐药检测的分子诊断设备；全国几乎100%的省级结核病实验室具备了快速分子菌种鉴定的能力。除此之外，通过分析分枝杆菌的生物标志，从而确定其基因型，进而分析Mtb在人群中的流行变异趋势和分布情况的基因分型技术在各省已经被广泛使用，常用的基因分型方法主要有：IS6110-限制性酶切片段长度多态性分析(IS6110-RFLP)、可变数量串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)分析、分枝杆菌散在分布重复单位(Mycobacterial interpersed repetitive units，MIRU)分型、间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析、长片段多态性分析(large sequence polymorphism，LSP)，以及缺失图谱等方法。基因分型技术可以在一定条件下追溯和确定传染源，鉴别未知传播，发现和鉴别培养的假阳性。对于Mtb基因分型来讲，目前可以选择的手段较多，技术也比较成熟，如何对基因分型结果进行诠释是其关键所在。

小 结

我国结核病实验室诊断体系已经建立多年，总体上由三部分组成。第一，国家、省、地(市)和区(县)的疾控机构结核病实验室体系，这个网络中的地(市)级、区(县)级结核病实验室，当前以细菌学检查为主要技术手段，全国1/3的区(县)级实验室配备了分子诊断设备，2/3以上的地(市)级实验室具备开展快速药敏试验和分子生物学菌种鉴定的能力。第二，结核病定点医院和专科医院结核病实验室，绝大多数可以开展涂片镜检、分离培养和药敏试验等较为全面的细菌学检查工作，也能够采用快速培养方法和分子生物学技术对于一些特殊患者进行鉴别诊断。第三，综合医疗机构的结核病实验室，可以开展细菌学检查和一些新的实验室诊断方法。目前，在所有上述实验室中，涂片显微镜检查的质量控制体系主要在结核病防治系统内得到了规范和标准化，医疗机构检验科的结核病实验室正在逐步加入质控体系和走向进一步规范化的进程中，传统药敏试验和分子诊断技术的质量保证体系以及能力验证工作正在全国按计划逐步扩展，预计在2015年底前将全面覆盖。

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