自体脂肪复合L-PRF移植技术研究进展

高景恒

评 论

自体脂肪复合L-PRF移植技术研究进展

高景恒

自体脂肪； L-PRF； 移植

白细胞-富含血小板血浆(leucocyte and platelet-rich plasma, L-PRP)技术是第二代富含血小板浓缩物，即含白细胞和丰富的血小板纤维蛋白。该技术由法国Choukron于2000年首先提出，这是再生医学，也是细胞疗法的又一创新发展[1-6]。

1984年，RK Assoian等从人血中提取富含血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)。经十余年的研究，2009年，DM Dohan Ehrenfest等对血小板浓缩技术的有效性仍有争议。根据分离不同血小板浓缩物白细胞纤维蛋白的含量，将其分为4种类型：①纯富含血小板血浆(pure platelet-rich plasma, P-PRP)，如PRP细胞分离器，Vivostat PRF或Anitua′s SPRGF；②白细胞-富含血小板血浆(leucocyte and platelet-rich plasma, L-PRP)；③纯富含血小板纤维蛋白(pure platelet-rich fibrin, P-PRF)，如Fibrinet等；④L-PRF。有多种血小板凝聚物收集系统(consentrate collection system, PCCS)[7-10]。2003年，日本东京大学吉村浩太郎首先报道了辅助细胞脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL)，认为基质血管细胞群(stromal vascular franction, SVF)辅助细胞是从抽吸脂肪中提取的细胞群[4,7]。近年来，国内外学者报道了4种移植方法：①自体脂肪复合PRP移植；②自体脂肪复合PRF移植；③自体脂肪复合SVF和PRP移植；④自体脂肪复合SVF和PRF移植等[11]。

1 PRP

1975年，Oen和Hobbs首先描述利用PRP。1984年，RK Assoian等从血浆中提取了富含血小板血浆。1987年，M Ferrari等通过临床应用，在美容整形外科和再生医学领域取得了新的进展。1999年，报道了PRP在骨、肌腱、运动损伤、皮肤溃疡等再生中取得了明显疗效。并发现含有多种细胞因子，如转化生长因子β1、β2(transfarming growth factor β1,-β2， TGF-β1,-β2),血小板源性生长因子(platelet derived growth factor， PDGF)，血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor， VEGF)，胰岛样生长因子(insulin like growth factor， IGF)，碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblastic growth factor， bFGF)，成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF),表皮生长因子(epidemal growth factor, EGF)，白介素8(interleukin 8)，角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor)，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor)等[9-10,12-17]。

PRP的制备技术无统一标准。大致可分为一次离心、二次离心、三次离心法，因转速和离心时间不同，又出现多种制备方法，而不同的制备方法，血小板的活性也不同。PRP的制备需加抗凝剂(枸缘酸钠)凝血酶、氯化钙等外源性物质，有可能过敏和交叉感染等[18-25]。

PRP中除含有大量的血小板外，还含有一定量的血浆，其中包括纤维蛋白质、纤维结合素和玻璃黏连蛋白等。其聚合作用组成生长因子载体，也是细胞黏附因子。在过去30年中，RK Assoian等研究报道，从静脉血中提取制成，现统称的PRP，其特点是：①通过抗凝抽取静脉血离心而获得的血小板浓缩物；②网状结构内含有多种细胞因子；③PRP制备方法繁多，无统一标准，其制备方法不同血小板的活性就不同，有可能引起过敏及交叉感染等；④单一注射PRPM(富含血小板基质)可使面部组织增生和皱纹平滑；⑤PRP的制备需加入抗凝剂(枸缘酸钠等)，凝血酶，氯化钙等外源性物质，而PRF无需加入上述制剂；⑥PRF的网状结构比PRP更致密。

2 纤维蛋白凝胶

纤维蛋白在其凝血过程中的作用早已(40年前)应用于创伤修复中。纤维蛋白凝胶(fibrin sealant/fibrin adhesive)主要包括两部分：纤维蛋白质(VIII因子，纤维结合素)和凝血酶(氯化钙，纤溶抑制剂)。在37℃环境下，将两部分混合形成凝胶，用于血管修复、脑脊液漏修补、气胸修补、肝脾止血，以及皮肤移植。其历史演变是：①1909年，Bergel报道，纤维蛋白粉末用于止血；②1974年，Kudema和Matras首次使用神经修复；③1982年，Matras用于拔牙后填充等应用；④1991年，G Hots等与羟基磷灰石联合应用修复牙槽嵴；⑤1994年，Tayapongsak等与自体骨混合重建下颌骨。

上述说明，纤维蛋白是一种生物胶，其周围可聚集大量的血小板，粘附血管，帮助止血，使细胞长入并促进血管化，刺激细胞的再生，从而使人们研究出富含血小板血浆浓缩物内含有大量的生长因子，将细胞治疗用于临床整形和美容再生[25-26]。

3 富含白细胞血小板纤维蛋白的研究与应用

Choukron′s技术，亦称PRF提取技术。该技术的提取物(PRF)在与SVF的CAL技术的复合应用[4]中，其关键步骤是：①抽吸脂肪；②分别从抽吸的脂肪中提取和分离完整的脂肪颗粒(adipose granus， AG)和SVF；③抽取抗凝的自体静脉血5～10 ml迅速提取(快速离心)PRF；④将脂肪+SVF+PRF复合移植。崔冬和郭树忠等研究证明，PRF能明显促进ADSCs的增殖和成脂分化[10-11]。赵建辉和郭树忠等复习国内外文献，关于富血小板纤维蛋白及其在脂肪移植中的作用[27]。

令狐大科等的研究认为，SVF复合PRF移植促进了脂肪来源干细胞的再血管化和生长因子的释放能量，能降低移植脂肪的吸收率并提高疗效。谭新颖、令狐大科等研究证明，SVF复合PRF，自体脂肪复合移植具有操作简单，安全有效，价格低廉等优点，能有效降低移植脂肪的吸收率，提高疗效。这是一项新型的自体脂肪复合移植技术，有广阔的临床应用前景[1-2,5-13]。

血小板浓缩物最早应用于输血医学。在过去的十年里，Whitman等首先进行大量的血小板浓缩物促进组织再生的研究。血小板内富含大量的细胞因子，刺激细胞增殖，新生组织的再血管化。PRP与L-PRF均为自体全血快速离心后得到的血小板浓缩物。Choukroun等提取L-PRF的研究证实，其制备方法简单便捷，灵活，易于在临床推广，称之为Choukroun′s技术[3]。

Choukroun′s技术富含L-PRF的提取技术，简单易行。在无菌条件下，取患者的静脉血5～10 ml，置入无菌负压管内，并迅速经3000 r/min离心10 min后取出，可见离心管内分为3层，上层呈淡黄色透明清亮的液体为血小板血浆(platelet poor plasma， PPP)；中层为淡黄色凝胶状物质为PRF膜；下层的细胞碎片为暗红色物质。弃上清液，取中层及部分下层，即为初级PRF。将此经干燥容器中10 min干燥，再经挤压称膜状的PRF[5-9]。AP Sclafani于2010年报道，富含血小板纤维蛋白基质(platelet rich fibrin matrix， PRFM)填充鼻唇沟，对刺激真皮生成有重要的潜能。

4 自体脂肪复合移植技术的临床应用及创新发展

自20世纪90年代始，采用脂肪细胞/脂肪颗粒注射移植技术移植脂肪细胞，其吸收率达20%～70%，常伴有囊肿、硬结、液化、坏死、感染和窦道等。自2003年，日本东京大学吉村浩太郎首先报道了CAL技术(辅助细胞脂肪移植)。其辅助细胞是指从抽取的脂肪中分离提取基质血管细胞群组(stromal vascular fraction， SVF)。2006年，吉村浩太郎报道了400余例CAL隆乳术，其结论是安全有效的，成活率高达70%以上。

20世纪，RK Assoian(1984年)，M Ferrari(1987年)，1999年E Anitua和2009年DM Dohan Ehrenfest等分别报道4项分类技术：①自体脂肪(adipose graft, AG)复合PRP移植技术；② AG复合PRF移植技术；③自体脂肪SVF复合PRP移植技术；④自体脂肪SVF复合PRF移植技术[27]。

4.1 AG复合PRP移植技术 2011年，V Cervelli等经临床研究证明，AG+SVF和PRP联合移植治疗创伤后的下肢溃疡，优于透明质酸和AG+PRP，是P-PRP技术[28-29]。

1999年，Anitua首先报道PRP的临床应用。2013年，V Cervelli等报道富含血小板脂肪移植(platelet-rich lipotransfer， PRL)，治疗223例软组织缺损，包括溃疡、Romberg综合征、半面部萎缩、衰老患者，取得了再生效果[12,29]。2009年，V Cervelli等报道43例患者，脂肪移植混合有PRP，其76%用于面部，88.9%用于下肢溃疡。PRP悬浮在胶质中治疗效果优于透明质酸和胶原，而脂肪与PRP混合移植优于单纯脂肪移植的效果[13-15]。

2009年，NS Araro等对PRP进行了深入广泛的文献复习指出：①自体浓缩的血小板血浆广泛地用于软、硬组织的愈合，可促进其愈合。由于有丰富的生长因子参与，证明了软、硬组织愈合的分子学基础[21-24,30-35]。

4.2 AG复合PRF移植技术 PRF是PRP的第二代血小板的产品，2000年，首先由法国的Choukron等描述。其优点超越第一代的PRP[20]，即L-PRF技术。PRF是采用自体静脉血，无任何添加剂，经快速离心和自然凝血而获得白血球、血小板、纤维蛋白浓缩物，其中含有纤维蛋白的基质聚合物、白细胞、细胞因子和循环干细胞。即将PRF分为两种：①白细胞含量，P-PRF和L-PRF。PRF技术广泛应用在整形美容外科、口腔颌面外科等。2013年，CE Sommeling等对PRP进行全面系统的文献复习指出，PRP有利于伤口的愈合，可提高移植脂肪成活率及增强移植的再生能力[27,31-36]。AP Sclafani(2009年)和M Saman(2012年)等报道，AG+PRF广泛应用在美容外科，其效果比PRP更稳定和持久[10-11]。

4.3 自体脂肪SVF复合PRP移植技术 该技术是在SVF基础上的复合PRP技术。SVF平均细胞数量是(4.80±3.79)×107/ml，平均细胞成活71.8%。 Liu等[4]报道，脂肪(AG)+SVF+PRF组的脂肪成活优于AG+NS对照组，AG+SVF组和AG+PRF组(P<0.01)，从而可提高自体脂肪移植成活率的疗效。2009年，V Cervelli等报道，AG+PRP组形态和容量恢复多达70%，体外实验证明，PRP的诱发能增加脂肪来源干细胞，同时可快速使溃疡再表皮化，促进面部的年轻化，使乳房增大形态恢复达69%[13,14-16,18-19,21，32]，PRP释放各种生长因子，刺激脂肪细胞成活[33-34]。采用浓缩的血小板治疗膝关节成形，取得了较好的效果，而PRP联合像束激光的应用促进了面部年轻化[24-25]。PRP联合四环素和人的重组细胞因子诱发骨移植的愈合(J Yoo, 2008)。V Cervelli等报道，PRP促进软、硬组织损伤的再表皮化率达73.3%,单纯透明质酸仅占30%。有学者报道，PRP增加移植脂肪的成活[35-36]。Pietro crintile等报道，AG+SVF+PRP联合移植增大乳房23例，维持乳房容积1年者达69%，单纯AG对照组约为39%，结论是有效安全的[31]。

4.4 自体脂肪SVF复合PRF移植技术 亦称自体脂肪复合富含血小板纤维蛋白移植技术。2009年，Monclus和Fuertes等报道，富含血小板纤维蛋白(vivostat PRF)治疗慢性溃疡10例，取得了良好的效果(达70%)[31]。2013年，Keyhan等报道，自体脂肪复合PRF治疗面部年轻化优于AG和PRP组[37]。Sclafani和Saman报道，PRFM和AG注射增大面部体积[38]。2013年，Kumar和Shubhashini研究认为，PRF是第二代的PRP，其制备和应用容易简单，价格低廉。作者推荐将PRF应用于软、硬组织缺损的再造[38-41]。Gentile等于2013年报道自体脂肪+SVF+PRF注射移植增大乳房容积，观察1年后，乳房容积仍维持69%[39]。2013年，Keyhan 等临床研究证明，自体脂肪+SVF+PRF联合移植优于脂肪+PRP联合移植[41]。

5 结论

笔者在CAL脂肪移植的基础上报道PRP、PRF、AG+PRP、AG+PRF、AG+SVF+PRP、AG+SVF+PRF移植技术。国内外研究者证实，在CAL技术中SVF与浓缩血小板技术联合应用提高了自体脂肪移植的成活率，提高了脂肪细胞移植的疗效。其结论需要以循证医学为指导，进一步寻找基础研究和临床证据，以确定其各种类型的更深刻、充实、确切的疗效以及他们之间的疗效差异性[42-55]。

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110016 辽宁 沈阳，辽宁省人民医院

高景恒(1935-),男，河北人，主任医师，教授.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.020

2014-03-12)