microRNA概述及其研究进展

齐 斌 综述 余丽梅 审校

microRNA概述及其研究进展

齐 斌 综述 余丽梅 审校

microRNA是一类长约20～22个核苷酸的非编码小RNA，能够在转录后水平调控基因表达，在细胞衰老、疾病发生发展等多种生命进程中具有重要的调控作用，在抗衰老和多种疾病治疗方面具有巨大的应用潜力。近年来，microRNA在组织工程等领域均成为研究热点。本文对microRNA的生物合成过程、作用机制，及其与衰老相关疾病的关系和临床应用进展进行综述。

组织工程小核糖核酸合成过程作用机制细胞衰老临床应用

组织工程兴起于上世纪80年代，其核心是利用细胞与生物材料研究开发具有生物活性的人工替代物，以维持、恢复和提高人体受损组织功能。种子细胞是组织工程的三大核心之一，获取足量且优质的种子细胞是重建组织器官的基础，是开展组织工程研究的前提。由最初的各种体细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、骨细胞，到现在以各种类型的干细胞作为主要的种子细胞，组织工程取得了快速的发展。microRNA作为重要调节因子，对各种干细胞的增殖、分化、干性维持等都具有重要的调节作用。其对体外培养过程中，维持细胞的增殖能力，以获取足够数量种子细胞，维持细胞培养过程中的干性，以及诱导体细胞重编以发现新的种子细胞等方面都具有重要的研究价值。另外，microRNA又可以作为生物标记物，在种子细胞的优选方面发挥重要作用。

1 microRNA的发现及合成过程

1993年，Lee等对秀丽隐杆线虫的早期发育进行遗传筛选时，发现了一种不编码蛋白质的基因：lin-4。lin-4并不编码蛋白，但能够产生一对小的RNA。后来，人们认识到lin-4是一类丰富的小的调控RNA的一员，即所谓的microRNA。

microRNA是一类长约21-23个核苷酸的非编码单链RNA分子，作用于靶基因的3'非编码端，抑制靶模板RNA（mRNA）的翻译，或使其降解来发挥作用，在干细胞的更新、分化、细胞周期和细胞凋亡等生物学进程中，都发挥重要的调控作用[1]。microRNA成熟之前要经历一系列的改变，经典的microRNA合成途径是，首先在细胞核内microRNA表现为较长的RNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）的转录产物—初级微小RNA（pri-microRNAs），大约50%的microRNA具有自己的启动子，另一半则存在于编码或非编码区的内含子或外显子中。pri-microRNA由上千个核苷酸组成，并具有发卡状茎环结构，而microRNA就包含在pri-mRNA的发卡状茎环结构中，当pri-microRNA合成后，它的发卡状结构立刻被剪切下来成为pre-microRNA。这个过程是在细胞核中进行的，由核糖核酸酶Ⅲ型蛋白Drosha进行，且需要辅因子DGCR8（Di-George syndrome critical region gene 8）的参与，Drosha与DGCR8共同组成微处理器复合体。下一步，pre-microRNA经Ran-GTP依赖性核浆转运子、转运蛋白Exporting-5转运到细胞质中，并且此过程中其序列和结构的完整性得到保护。在转运到细胞质中后，转运复合体去磷酸化，GTP转变成GDP，从而释放pre-microRNA，然后由另一种RNaseⅢ—Dicer酶把pre-microRNA剪切为小的双链RNA（dsRNA），双链中的一条为成熟的microRNA，另一条则为它的互补链。然后下一步加工过程将用到TRBP（Transactivation response RNA-Bindng domain）。它能够与dsRNA结合域结合然后富集阿古尔蛋白（Ago2），Ago2是RISC（RNA induced Silencing Complex）的主要组成部分。RISC的作用是选择性结合两条链中5'端热力学稳定性最差的那一条，那么这条链即为成熟的microRNA，另一条则为互补链。互补链没有结合RISC，因此在体内应是趋向于降解的，但是microRNA文库法检测不同组织中的microRNA时，仍能检测到这条互补链。Ro等[2]对小鼠和人的969个microRNA进行分析时证实，其中有117个是互补链，说明也可能存在双链的microRNA。而且不论是成熟的microRNA，或者它的互补链，都具有组织特异性，如miR-30e-3p在胃组织中富集，而它的互补链miR-30e-5p则在胰腺组织中含量丰富。

2 microRNA的生物学作用及机制

随着microRNA表达谱芯片、生物信息学技术等新技术的应用，越来越多的microRNA在动植物甚至病毒中被发现。新版本的miR Base 20.0数据显示，microRNA发夹前体序列已升至24 521条，成熟microRNA序列升至30 424条。小鼠成熟的microRNA新增至1 908条，大鼠成熟的microRNA新增至728条，人类成熟的microRNA则新增至2 578条。

microRNA在动植物的生命过程中起着重要的调控作用。Palatnik等证实，miR-Jaw控制植物叶和其他细胞分裂。Millar等证明，miR-159在拟南芥中通过调控MYB33和MYB65两种转录基因，调节植物的生殖发育。mir-164通过对靶基因CUP SHAPED COTYLEDON(CUP)1,2等的作用，调控分裂组织的边界和胚胎、营养器官和花的形成，miR-164过量表达会导致花器官或叶子的融合。Brennecke等在果蝇中发现，microRNA-bantam作用于基因hid，并负性调节细胞的程序性死亡。Giraldez等在dicer突变型斑马鱼的胚胎中注射miR-430，有效地改变了大脑畸形，也可在某种程度上调节神经发育。

在人类衰老相关性疾病中，如心脑血管性疾病、纤维化疾病、神经退行性疾病等，都存在microRNA差异性改变。Hebert等发现，阿兹海默症患者的大脑组织中miR-29的表达量下调。Persengiev等发现，在人的小脑衰老过程中，miR-144表达量升高。Drummond等发现，在人类骨骼肌细胞衰老过程中Let-7b和Let-7c的表达量升高。microRNA的异常表达也与许多疾病相关，如癌症、精神分裂症、肾功能障碍、妥瑞综合症、牛皮癣、原发性肌肉疾病、脆性X染色体综合症、慢性肝炎、真性红细胞增多、艾滋病和肥胖等[3]。现已证实，microRNA广泛存在于真核生物体细胞中，是最大的基因家族之一，大约占整个基因组的1%[4]，每个microRNA都具有上百甚至上千个靶基因，如Calin等[5]证明miR-15a/16-1家族能够直接或间接调控白细胞中14%的基因。至今人们已发现人类有1/3的基因受到microRNA的调控[6]。

microRNA在细胞的衰老过程中具有重要的调控作用，而细胞衰老是导致组织和机体衰老的重要因素。如Menghini等发现，microRNA-217能够同时抑制SIRT1和FOXO1的去乙酰化，诱导内皮细胞的衰老。Mudhasani等发现，一些microRNA的缺失能够导致P53和P19的表达量升高，使胚胎成纤维细胞衰老。Bai等发现，miR-34a和miR-335在肾脏系膜细胞衰老过程中表达上调，导致细胞线粒体中的活性氧自由基升高，引起细胞的衰老。

microRNA也被证实在胚胎干细胞中，对干细胞的自我更新、多向分化有着重要的调控作用。首次发现的调控分化证据来自小鼠和人类胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）的研究。microRNA的缺失会导致体外培养的胚胎干细胞增殖和分化能力缺失，而且dicer酶缺失的小鼠也会在发育早期死亡[7]。研究表明，胚胎干细胞中表达特异的microRNA，如Morin等[8]的多项研究证明，在鼠或人的ESC分化过程中存在一系列的microRNA差异表达。干细胞中这些microRNA的表达水平并不是很高，但microRNA在不同细胞状态动态水平的差异，也间接证明了microRNA对干细胞特性的调节作用。

microRNA调节基因在转录后的表达水平，而且对于hESC的自我更新能力、干性的维持[9-10]和分化[8]至关重要。干细胞中的核心转录因子，如Oct4、Sox2和Nanog能够促进胚胎干细胞中特有的基因表达，并抑制分化[11]，而如果将这些核心转录子导入鼠或人的成体细胞中，则能够将成体细胞重编程为细胞表型、功能都与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞（IPSCs）。而一些microRNA已经证明与这些核心的转录因子有直接的联系，如miR-145抑制核心转录因子Oct-4、Sox2、kif4的3'UTR端[12]。miR-134、miR-296、和miR-470靶向抑制小鼠Nanog、Oct-4、Sox2的DNA编码序列[13]。

成熟的microRNA在Ago2等蛋白的引导下，结合到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing coplex，RISC），并由RISC介导，通过microRNAs 5'端第2～7碱基的8个核苷酸序列，即“种子序列”（Seed sequence），与靶向mRNA的3'端非翻译区（3'untranslate region，3'UTR）结合，对靶基因进行切割或翻译抑制，从而调控基因的表达。实际上，大多数的生物信息学分析软件预测microRNA的靶基因时，都是遵循这个种子序列配对的原则。大量研究也表明，遵循该种子序列配对方法预测的靶基因大部分是正确的，也就有了“种子规律”[14]这一经典的预测microRNA干预靶基因的理论方法。但是，也有些microRNA不遵循此规律，而仍然起到基因沉默的作用[15]。近期的研究表明，microRNA除了作用于mRNA的3'UTR的经典沉默机制，还可以作用于5'UTR[16]、启动子区[17]，甚至是mRNA的编码区[13]。而且，microRNA对靶基因的选择并不要求种子序列完全配对。因此，一个microRNA可能同时抑制上百个不同的信使RNA[18]。所以，microRNA的作用也可视为它对多个靶点抑制的协同作用结果。

3 microRNA的临床应用

2008年，Lawire等[19]在血液中发现了循环的microRNA，他证明mir-21和mir-155的含量增加与否，能够鉴别B细胞淋巴瘤患者与健康人，在microRNA研究领域开拓了一条新的研究方向。随后大量研究在血液、尿液、唾液和其他体液中发现了与许多疾病相关的microRNA。2010年，Weber等[20]在健康成人的12种体液中提取了上百种microRNA。他们检测了血浆、唾液、眼泪、尿液、羊水、乳汁、支气管分泌物、脑脊液、腹水、精液中microRNA的表达量，不同体液中检测到的microRNA数量从200到450个不等。而且证明了不同的体液中，部分microRNA的表达是特异性的，如mir-577在脑脊液中特异表达。而且不同于信使RNA，循环系统中的microRNA稳定性非常好，即使反复冻融或者在长时间的室温下仍可保持稳定[21]。且循环系统中的microRNA还有个重要的特性，它们是游离态的，不论是囊泡中的microRNA还是与蛋白结合的microRNA[22-23]。microRNA的这些特性都表明，microRNA有希望成为疾病诊断的重要依据。如Chen等[24]对10个血清microRNA组合进行研究，在他的研究中有200例非小细胞型肺癌和110例对照组，检测的灵敏度和特异性分别能够达到92.5%和90%。且在回顾性研究中，这10个microRNA组合的检测也能够达到7个患者中成功预测6个患者的非小细胞肺癌，并且比现在的检测方法提早33个月。在相似的研究中，Boeri等[25]以吸烟人群血浆中的15个microRNA作为检测对象来预测早期肺癌，敏感性达到75%，特异性达到100%。Fu等[26]检测了肺结核病人血清中的microRNA变化，有59个下调，33个上调，其中miR-29a具有最好的预测价值，感染患者中表达上升了11倍。通过mir-29a检测结核患者，敏感性达83%，特异性达到80%。Henegan等[27]通过检测患者血清中miR-195来诊断乳腺癌，敏感性87.7%，特异性91%。miR-195能够在乳腺癌早期就被检测到，这时肿瘤直径还小于2 cm。尤为重要的是，mir-195与肿瘤的大小具有明显的相关性。当患者实施乳腺癌切除术后，mir-195的水平恢复正常，表明miR-195也能够作为术后随诊的一项重要指标。Li等[28]发现，血液中的microRNA可作为鉴别不同原因肝损伤的工具，敏感性和特异性均超过96.9%。如检测miR-375、miR-10a、和miR-223可用来鉴别乙型肝炎患者和健康人，敏感性99.3%，特异性98.8%。

4 展望

随着越来越多的microRNA被发现，其生理功能和调控机制也越来越清楚。胚胎干细胞和成体干细胞作为组织工程重要的种子细胞，microRNA对各种生物学行为及功能的调节作用将使microRNA在干细胞的组织工程应用中发挥重要作用，可通过查阅人类microRNA疾病数据库（http:// 202.38.126.151/hmdd/miRNA/md/），来查找与特定疾病相关的microRNA。microRNA调节异常和人类衰老相关性疾病等具有相关性，可通过干预单个或多个microRNA，观察microRNA对细胞衰老和个体衰老或相关疾病的影响，发掘microRNA在抗衰老或疾病治疗方面的潜力。同时，作为一种生物标记物，也将在种子细胞优选和疾病的诊断、预防方面发挥潜力。

[1]Hatfield SD,Ruohola-Baker H.MicroRNA:a new player in stem cells[J].Cell Tissue Res,2008,331:57-66.

[2]Ro S,Park C,Young D,et al.Tissue-dependent paired expression of miRNAs[J].Nucleic Acids Res,2007,35(17):5944-5953.

[3]Garg M.MicroRNAs,stem cells and cancer stem cells[J].World J Stem Cells,2012,4(7):62-70.

[4]Barteln DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-282.

[5]Calin GA,Cimmino A,Fabbri M,et al.MiR-15a and miR-16-1 cluster functions in human leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(13):5166-5171.

[6]Davis BN,Hata A.Regulation of MicroRNA Biogenesis:A miRiad of mechanisms[J].Cell Commun Signal,2009,7:18.

[7]Martinez NJ,Gregory RI.MicroRNA gene regulatory pathways in the establishment and maintenance of ESC identity[J].Cell Stem Cell,2010,7(1):31-35.

[8]Morin RD,O'Connor MD,Griffith M,et al.Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells[J].Genome Res,2008,18(4):610-621.

[9]Melton C,Blelloch R.MicroRNA regulation of embryonic stem cell self-renewal and differentiation[J].Adv Exp Med Biol, 2010,695:105-117.

[10]Melton C,Judson RL,Blelloch R.Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells[J].Nature, 2010,463(7281):621-626.

[11]Chen X,Xu H,Yuan P,et al.Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells[J].Cell,2008,133(6):1106-1117.

[12]Xu N,Papagiannakopoulos T,Pan G,et al.MicroRNA-145 regulates OCT4,SOX2,and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J].Cell,2009,137(4):647-658.

[13]Tay Y,Zhang J,Thomson AM,et al.MicroRNAs to Nanog,Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation [J].Nature,2008,455(7216):1124-1128.

[14]Flynt AS,Lai EC.Biological principles of microRNA-mediated regulation:shared themes amid diversity[J].Nat Rev Genet,2008, 9(11):831-842.

[15]Stern-Ginossar N,Elefant N,Zimmermann A,et al.Host immune system gene targeting by a viral miRNA[J].Science,2007,317 (5836):376-381.

[16]Orom UA,Nielsen FC,Lund AH.MicroRNA-10a binds the 5’UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation[J]. Mol Cell,2008,30(4):460-471.

[17]Place RF,Li LC,Pookot D,et al.MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(5):1608-1613.

[18]Baek D,Villen J,Shin C,et al.The impact of microRNAs on protein output[J].Nature,2008,455(7209):64-71.

[19]Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large b-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008,141(5):672-675.

[20]Weber JA,Baxter DH,Zhang S,et al.The microRNA spectrum in 12 body fluids[J].Clin Chem,2010,56(11):1733-1741.

[21]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[22]Théry C.Exosomes:secreted vesicles and intercellular communications[J].F1000 Biol Rep,2011,3:15.

[23]Arroyo JD,Chevillet JR,Kroh EM,et al.Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(12):5003-5008.

[24]Chen X,Hu Z,Wang W,et al.Identification of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as novel noninvasive biomarkers for nonsmall cell lung cancer diagnosis [J].Int J Cancer,2012,130(7):1620-1628.

[25]Boeri M,Verri C,Conte D,et al.MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(9):3713-3718.

[26]Fu Y,Yi Z,Wu X,et al.Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2011,49(12):4246-4251.

[27]Heneghan HM,Miller N,Kelly R,et al.Systemic miRNA-195 differentiates breast cancer from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and early stage disease[J].Oncologist,2010,15(7):673-682.

[28]Li LM,Hu ZB,Zhou ZX,et al.Serum microRNA profiles serve as novel biomarkers for HBV infection and diagnosis of HBV-positive hepatocarcinoma[J].Cancer Res,2010,70(23):9798-9807.

Overview and Research Progress of microRNA

QI Bin,YU Limei.
Zunyi Medical college,Zunyi 563000,China.

【Summary】The microRNA is only 20-22 nucleotides in length and can work as post-DNA transcription regulator for gene expression.It has an important regulating role in the life process such as cell aging,disease and so on.So microRNA has a huge potential for anti-aging and disease treatment.Nowadays it has become one of the most intense interests to the tissue engineering and other area of medicine.In this paper,the biogenesis,mechanism,relationship with cell aging and ageassociated diseases and the clinical application of microRNA were reviewed.

Tissue engineering;microRNA;Biogenesis;Mechanism;Cell ageing;Clinical application

Q522

B

1673－0364（2014）06－03－03

2014年5月11日；

2014年6月30日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.016

563000贵州省遵义市遵义医学院。