脂肪干细胞和支架材料在脂肪组织工程中的应用现状和研究进展

徐 婷， 吴慧玲

综 述

脂肪干细胞和支架材料在脂肪组织工程中的应用现状和研究进展

徐 婷， 吴慧玲

脂肪干细胞； 支架材料； 组织工程

长期以来，各种原因所造成的原发与继发性软组织缺损及发育不良严重影响人们的身心健康。软组织缺损的修复一直是困扰整形外科医师的难题之一[1]。真皮移植、脂肪组织瓣、自体脂肪移植以及人工合成材料被广泛应用于临床工作中。近年来，随着组织工程技术的兴起和迅猛发展，为组织或器官缺损的修复及功能重建开辟了新的治疗途径，使得脂肪移植再次成为整形外科的研究热点[2]。组织工程的研究领域很广，包括骨骼、皮肤、软骨、血管和脂肪组织等，脂肪组织工程技术将成为重建脂肪组织，修复重建软组织缺损的理想方法[3]。成功构建组织工程化脂肪的关键因素包括种子细胞、三维支架材料和维持细胞增殖和组织功能的微环境。现笔者主要对脂肪组织工程脂肪源性干细胞和支架材料相关研究现状进行综述。

1 干细胞和脂肪来源干细胞

在组织工程的研究和应用中，获得足够数量、无免疫排斥反应且具有再生活力的种子细胞，是开展组织工程研究的前提和基础。干细胞是一类未分化、具有自我更新与增殖分化能力的细胞群。组织工程化脂肪组织移植的干细胞，包括胚胎干细胞、骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymad stem cells, MSCs)和脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)等。然而，胚胎干细胞涉及伦理道德问题导致来源非常困难，骨髓来源的间充质干细胞取材困难，获取率低也满足不了临床的需要[4]。ADSCs是存在于脂肪组织中的一种成体干细胞，为中胚层来源，并具有其他成体干细胞一样的自我更新和多向分化的能力，同时具有旁分泌功能[5]。不同于胚胎干细胞和骨髓干细胞，ADSCs既不涉及伦理问题又易于获得[6-7]。基于其多潜能分化和旁分泌功能，ADSCs在组织工程干细胞治疗领域被认为是继胚胎干细胞和骨髓干细胞之后又一新热点。

2002年，PA Zuk等首次从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中分离了具有多向分化潜能的细胞，命名为脂肪抽吸术后细胞，并通过各相关因子表达，排除了混杂骨髓间充质干细胞的可能性，证实了ADSCs的存在。最近ADSCs已被成功分离并被证实在特定诱导条件下，还可向非中胚层起源的细胞分化，如内皮细胞、神经元、胰腺细胞、肝细胞和心肌细胞等[6]。不仅如此，相比于其他种子细胞，ADSCs有着来源广泛、含量丰富、分离简单、体外扩增稳定容易的优点。采用吸脂术获取ADSCs具有对供区损伤小、风险低，人们极少有抵触心理，而且痛苦小，不涉及伦理道德问题，可以自体移植，已成为脂肪组织工程种子细胞的理想来源[3]。正常脂肪组织内的ADSCs无须诱导可自然分化成脂肪细胞，且ADSCs可以产生和分泌多种细胞因子，如bFGF、VEGF、HGF、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)、IGF-1等能够刺激血管内皮生长、改善组织缺血、抑制细胞凋亡。Rodriguez等[9]发现，人类脂肪来源的多能干细胞不仅能保持向脂肪细胞分化的潜能，而且经传代培养超过160代仍能保持这种潜能，这对于其应用于脂肪组织工程具有重大意义。

常用的ADSCs获取方法，主要包括从切取的脂肪组织中提取和从脂肪抽吸物中提取两方面[10-11]。颗粒脂肪获取后需通过冲洗、消化和扩增等步骤获取ADSCs。目前应用最广泛的ADSCs分离纯化方法是胶原酶消化法，所获得的细胞成分复杂，主要有间充质干细胞、脂肪前体细胞、成纤维细胞、内皮细胞、红细胞等成分，影响了ADSCs构建工程化组织的成功率及均质性。如何纯化ADSCs是脂肪组织构建工程亟待解决的问题。Zhu等[12]研究表明，ADSCs与MSCs在形态、生长动力学、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显的差别，尚无统一的标准区分两种干细胞。目前是从组织来源、特异性的表型特征及其分化潜能来综合识别ADSCs。据报道，ADSCs表面标志与MSCs非常相似，表达CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD54、CD55、CD71、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166和STRO-1等标记物，而不表达造血系细胞标记物、共刺激分子及部分黏附分子，如CD14、CD16、CD31、CD45、CD56、CD62E、CD79、CD104、CD117、CD31、CD144等。而ADSCs肯定表达CD49，而不表达CD106；MSC肯定表达CD106，而不表达CD49[11,13-14]。通过免疫标志对ADSCs进行有效筛选，可以得到较纯的ADSCs，有助于ADSCs的进一步研究。尽管对于ADSCs的多向分化潜能及表面抗原表达已有诸多研究报道，但有关ADSCs的特异性表面标志仍无统一认识。免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认ADSCs有辅助作用，而鉴定ADSCs的最好方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。

2 支架材料

2.1 天然来源材料

2.1.1 胶原 胶原广泛存在于细胞外基质和结缔组织中，是目前组织工程研究中最常用的天然生物材料。胶原蛋白有着良好的生物相容性，可被胶原蛋白酶和基质金属酶生物降解；可制成海绵状三维支架，承载多种细胞；能释放生物活性因子，可促进细胞增殖和分化，促进脂肪组织形成；可塑性良好，制备方便，是一种较理想的脂肪组织工程支架材料[15-17]。Itoi等[18]发现，Ⅰ型胶原海绵与聚乙醇酸和透明质酸凝胶相比，其是最适合做脂肪组织工程的支架材料。细胞-胶原蛋白复合物能形成有效的微环境网，提供丰富的血供，有利于新的脂肪组织的持续生成。但天然的胶原存在机械性能差且结构不规则，易于变形，植入体内后降解速度过快等不足，因而在组织工程支架材料的研究中，大多数采用干热、戊二醛或紫外辐照等方法交联，在改善降解速度的同时，提高其综合使用性能[19]。采用明胶作为生长因子如成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)的释放载体，以促进组织工程化新生组织中血管的形成[20-22]。胶原材料由于独特的生物学特性，在创伤修复和整形美容领域研究中已取得了可喜成果，作为组织工程载体材料的研究还需要进一步探索。

2.1.2 透明质酸 透明质酸(hyaluronic acid, HA)存在于正常的结缔组织基质中，在很多生物过程中起着重要作用，如组织水合作用、细胞分化、细胞行为和组织修复。由于结构疏松，含水及多孔性因而特别适合干细胞的迁移及增殖，防止干细胞过早地进行分化[23]。研究表明，人类前脂肪细胞可以成功地在HA支架上接种和培养，在体内能分化为成熟的脂肪细胞[24]。然而，高度亲水性导致了支架力学特性不佳，加之加工处理特性较差，严重制约了HA应用于组织工程学[25]。目前，有学者在保留HA生物活性的前提下，通过变联或偶联反应，对HA进行化学修饰以改变结构和性能。学者们用HA为原料合成透明质酸苄基酯(hyaluronan-based benzyl derivatives, HYAFF)支架，实验表明此支架具有良好的多孔结构、适合脂肪组织的流变学、适宜的降解率，并支持细胞黏附、渗透、增殖、血管增生[26]。

2.1.3 丝素蛋白 丝素蛋白来源于天然蚕丝或蛛丝，是一种天然结构蛋白。丝素蛋白具有较好的机械强度和柔韧性；可被蛋白酶水解，降解产物对周围组织有营养和修复作用；免疫原性低，生物相容性优于传统的人工合成材料，可以支持细胞黏附、分化和组织形成[27-29]。在组织工程应用中，丝素蛋白已经被广泛应用于组织构建的支架材料。Wang等[30]研究发现，丝素蛋白对前脂肪细胞具有良好的吸附作用，丝素蛋白三维多孔性支架材料在体内体外支持脂肪前体细胞增殖分化的能力与胶原和聚乳酸近似，但其降解率与机械性能优于胶原和聚乳酸，并能促进周边组织中的间充质细胞迁移分化成脂肪细胞。Altman等[31]在体外培养中发现，接种于丝素蛋白支架上的前脂肪细胞贴壁良好，生长增殖活跃，2周左右支架孔隙中充满前脂肪细胞，扫描电镜可见基质分泌。丝素蛋白与其他合成材料整合后，所获得的理化性能和生物学性能以及更加优良的复合型支架，将成为丝素蛋白构建工程化脂肪组织的重要方向之一。

2.2 人工合成材料

2.2.1 脂肪族聚酯材料 聚乳酸(polylatic acid, PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)为人工合成的脂肪族聚酯材料，具有良好的组织相容性、生物降解性及组织可吸收性，表面活性良好，是常用的细胞支架材料，被广泛应用于组织工程领域[32]。PLA和PGA是具有良好的生物相容性、可降解性和可渗透性，被广泛运用于脂肪组织工程的三维支架、移植物。体内外的研究表明,PLA和PGA有介导脂肪组织生成的能力。PGA分子的结构特点与PLA类似，二者在体内首先降解为乳酸，最终生成二氧化碳和水。

PLGA具有促进种子细胞的黏附、增殖、分化的特性，近年来研究比较广泛。PLGA通过孔隙间全连通的三维细胞支架，其催化降解行为被明显抑制，支架的外观尺寸和孔隙率稳定，有利于获得外观尺寸稳定的工程化组织[33-34]。PLGA多孔支架能促进种子细胞的黏附、增殖和分化，可作为构建工程化脂肪组织的支架材料。但目前尚未发现脂肪组织存活更长时间的实验报道。研究显示，PLGA与细胞的复合物植入体内5个月后完全消失，其原因，可能是ADSCs的数量和促进脂肪组织血管化的能力不足，影响了工程化脂肪组织的长期稳定存在。加入诸如bFGF等因子后将ADSCs接种在PLGA支架上，可见细胞逐渐扩展至支架孔隙，随着支架的降解，新的脂肪组织形成明显，伴有少量的血管长入[35-36]。此外，PLGA是通过水解酯键降解，降解产物乳酸和乙醇酸会降低局部的pH值，从而影响组织和细胞的黏附与生长[37]。近年来 ，研究人员通过溶剂蒸发技术在PLGA中加入三磷酸钠(sodium tripolyphosphate, STPP)，不仅能降低pH，而且能促进干细胞在该支架上增殖，该技术将会促进PLGA的临床应用[37]。目前仅有PLGA等少数几种此类材料被SFDA、FDA批准上市，且其来源主要靠进口，价格昂贵。这些因素在某种程度上限制了PLGA在脂肪组织工程中的应用。

2.2.2 HYAFF HYAFF是通过透明质酸和苯甲醇酯化形成的一类衍生物。不同的酯化程度可能引起不同的疏水度，孔隙尺寸的不同能导致细胞黏附的差异性。HYAFF具有良好的生物相容性、水稳定性等特性，是一种很有潜力的组织工程支架材料，其可以加工生产出很多生物相容性好的材料，比如导管、膜、纱布、海绵等，已经被广泛用于生物医学领域。此外，HYAFF有良好的生物降解速度，作为一种聚多糖，抗原性非常弱，可促进细胞-支架复合物血管形成。因此，HYAFF三维多孔支架在脂肪组织工程研究中具有广阔的前景。其中，HA苯甲基酯(HYAFF-11)是一种近年来发展的半合成的可吸收材料，通过酯化修饰，增强了疏水性，延长了在机体内的存在时间，可以更好地抵抗透明质酸酶的作用[26,38]。体内外研究已经证实，其对前脂肪细胞的增殖、分化有支持作用，研究表明孔径为400 μm的HYAFF支架适合前脂肪细胞增殖分化[26]。HYAFF在脂肪工程领域的研究尚处于起步阶段，还有许多问题需要进一步地探讨。

3 展望

现阶段脂肪组织工程的研究还处于早期，有许多问题还没有解决或需要进一步深入研究。成功构建稳定的脂肪组织需要有血管化的脂肪移植物支持，但血管形成与脂肪形成的相互关系、ADSC与生物材料表面的相互作用仍需深入研究。对于应用ADSC软组织填充的基础研究仍是未来研究的重点。要将组织工程技术构建的脂肪应用于临床，还需要对细胞表面相互作用、体内植入物及组织工程网络构架的生物活性组装与修饰等方面进行深入地研究。

[1] Casadei A, Epis R, Ferroni L, et al. Adipose tissue regeneration: a state of the art[J]. J Biomed Biotechnol, 2012, 2012: 462543.

[2] Vinci V, Borbon G, Codolini L, et al. Fat grafting versus adipose-derived stem cell therapy: distinguishing indications, techniques, and outcomes[J]. Aesthetic Plast Surg, 2013,37(4):856-857.

[3] Philips BJ, Marra KG, Rubin JP. Adipose stem cell-based soft tissue regeneration[J]. Expert Opin Biol Ther, 2012,12(2):155-163.

[4] West CC, Murray IR, Gonzalez ZN, et al. Ethical, legal and practical issues of establishing an adipose stem cell bank for research[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2014 Feb 1.

[5] Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B, et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applicatio-ns[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010,63(11):1886-1892.

[6] Konno M, Hamabe A, Hasegawa S, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells and regenerative medicine[J]. Dev Growth Differ, 2013,55(3):309-318.

[7] Ong WK, Sugii S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(6):1083-1086.

[8] Rodriguez AM, Elabd C, Delteil F, et al. Adipocyte differentiation of multipotent cells established from human adipose tissue[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,315(2):255-263.

[10] Vieira NM, Brandalise V, Zucconi E, et al. Isolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells[J]. Cell Transplant, 2010,19(3):279-289.

[11] Huang SJ, Fu RH, Shyu WC, et al. Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential[J]. Cell Transplant, 2013,22(4):701-709.

[12] Zhu X, Du J, Liu G. The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Clin Lab, 2012,58(9-10):897-903.

[13] Bailey AM, Kapur S, Katz AJ. Characterization of adipose-derived stem cells: an update[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2010,5(2):95.

[14] Bayati V, Hashemitabar M, Gazor R, et al. Expression of surface markers and myogenic potential of rat bone marrow- and adipose-derived stem cells: a comparative study[J]. Anat Cell Biol, 2013,46(2):113-121.

[15] Keck M, Haluza D, Selig HF, et al. Adipose tissue engineering: three different approaches to seed preadipocytes on a collagen-elastin matrix[J]. Ann Plast Surg, 2011,67(5):484-488.

[16] Lequeux C, Oni G, Wong C, et al. Subcutaneous fat tissue engineering using autologous adipose-derived stem cells seeded onto a collagen scaffold[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,130(6):1208-1217.

[17] Xie L, Zhang N, Marsano A, et al. In vitro mesenchymal trilineage differentiation and extracellular matrix production by adipose and bone marrow derived adult equine multipotent stromal cells on a collagen scaffold[J]. Stem Cell Rev, 2013,9(6):858-872.

[18] Itoi Y, Takatori M, Hyakusoku H, et al. Comparison of readily available scaffolds for adipose tissue engineering using adipose-derived stem cells[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010,63(5):858-864.

[19] Panda NN, Jonnalagadda S, Pramanik K. Development and evaluation of cross-linked collagen-hydroxyapatite scaffolds for tissue engineering[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2013,24(18):2031-2044.

[20] Ito R, Morimoto N, Liem PH, et al. Adipogenesis using human adipose tissue-derived stromal cells combined with a collagen/gelatin sponge sustaining release of basic fibroblast growth fact-or[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2012.

[21] Kimura Y, Inamoto T, Tabata Y. Adipose tissue formation in collagen scaffolds with different biodegradabilities[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2010,21(4):463-476.

[22] Kimura Y, Tsuji W, Yamashiro H, et al. In situ adipogenesis in fat tissue augmented by collagen scaffold with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2010,4(1):55-61.

[23] Collins MN, Birkinshaw C. Hyaluronic acid based scaffolds for tissue engineering--a review[J]. Carbohydr Polym, 2013,92(2):1262-1279.

[24] Altman AM, Abdul KF, Seidensticker M,et al. Human tissue-resident stem cells combined with hyaluronic acid gel provide fibrovascular-integrated soft-tissue augmentation in a murine photoaged skin model[J]. Plast Reconstr Surg, 2010,125(1):63-73.

[25] Elder AN, Dangelo NM, Kim SC, et al. Conjugation of beta-sheet peptides to modify the rheological properties of hyaluronic acid[J]. Biomacromolecules, 2011,12(7):2610-2616.

[26] Vindigni V, Tonello C, Lancerotto L, et al. Preliminary report of in vitro reconstruction of a vascularized tendonlike structure: a novel application for adipose-derived stem cells[J]. Ann Plast Surg, 2013,71(6):664-670.

[27] Bhattacharjee M, Schultz-Thater E, Trella E, et al. The role of 3D structure and protein conformation on the innate and adaptive immune responses to silk-based biomaterials[J]. Biomaterials, 2013,34(33):8161-8171.

[28] Preda RC, Leisk G, Omenetto F, et al. Bioengineered silk proteins to control cell and tissue functions[J]. Methods Mol Biol, 2013,996:19.

[29] Oliveira AL, Sun L, Kim HJ, et al. Aligned silk-based 3-D architectures for contact guidance in tissue engineering[J]. Acta Biomater, 2012,8(4):1530-1542.

[30] Wang X, Zhang X, Sun L, et al. Preadipocytes stimulate ductal morphogenesis and functional differentiation of human mammary epithelial cells on 3D silk scaffolds[J]. Tissue Eng Part A, 2009,15(10):3087-3098.

[31] Altman AM, Gupta V, Rios CN, et al. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix[J]. Acta Biomater, 2010,6(4):1388-1397.

[32] Liu X, Holzwarth JM, Ma PX. Functionalized synthetic biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering[J]. Macromol Biosci, 2012,12(7):911-919.

[33] Wang W, Cao B, Cui L, et al. Adipose tissue engineering with human adipose tissue-derived adult stem cells and a novel porous scaffold[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2013,101(1):68.

[34] Morgan SM, Ainsworth BJ, Kanczler JM, et al. Formation of a human-derived fat tissue layer in P(DL)LGA hollow fibre scaffolds for adipocyte tissue engineering[J]. Biomaterials, 2009,30(10):1910-1917.

[35] Marra KG, Defail AJ, Clavijo-Alvarez JA, et al. FGF-2 enhances vascularization for adipose tissue engineering[J]. Plast Reconstr Surg, 2008,121(4):1153-1164.

[36] Mahmoudifar N, Doran PM. Chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in polyglycolic acid mesh scaffolds under dynamic culture conditions[J]. Biomaterials, 2010,31(14):3858-3867.

[37] Xie S, Zhu Q, Wang B, et al. Incorporation of tripolyphosphate nanoparticles into fibrous poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissue engineering[J]. Biomaterials, 2010,31(19):5100-5109.

[38] Borzacchiello A, Mayol L, Ramires PA, et al. Structural and rheological characterization of hyaluronic acid-based scaffolds for adipose tissue engineering[J]. Biomaterials, 2007,28(30):4399-4408.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.012

2013-11-28)

浙江省自然科学基金资助项目(Y2110414)；浙江省教育厅科研资助项目(Y201016650)

310003 浙江 杭州,浙江大学医学院附属第一医院 整形美容中心

徐 婷(1985- )，女，浙江杭州人，医师.