萨福克羊GH和IGF－1基因组织表达水平的分析

闫云峰，杨 华，杨永林，潘晓亮＊，马全磊

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；2.新疆农垦科学院兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子832000）

20世纪90年代以来，随着世界养羊业结构的调整和重点的转移，养羊业由毛用型逐渐转向肉用型，肉羊业成为了国内外畜牧业发展的重要组成部分。随着国内人民生活水平日益提高及自我保健意识的逐渐增强，国内羊肉的需求量逐年增加，提高肉羊生产性能和改善肉质已成为肉羊业发展的重要目标之一。动物生长轴即GH－IGFs轴是近年来提高动物生长速度及生产性能的研究热点之一，而GH基因和IGF－1基因是动物生长轴上的重要基因，在动物的生长调控中起着非常重要的作用。颜炳学［1］证明GH基因是控制鸡部分屠体性状的主效基因，赵中权等［2］通过体外扩增证明猪GH基因第四外显子第1237位点突变与猪的生长密切相关，王宝维等［3］研究发现IGF－1基因与鸡的体重、胸宽及胫长指数等相关，谭颖［4］证明IGF－1基因显著影响古蔺马羊的产羔数。针对绵羊GH和IGF－1 基因表达的研究主要集中在肌内脂肪含量方面［5－6］，皮肤［7］及肝脏［8］而从mRNA 水平研究绵羊GH基因和IGF－1基因在不同组织表达的相关研究有待补充。因此，本研究以肉用性能突出的萨福克羔羊为研究材料，分析GH基因和IGF－1基因在绵羊不同组织中的表达特征，并初步分析GH基因和IGF－1基因对肉羊生长发育的作用，探讨GH 和IGF－1mRNA的发育性变化，为研究GH基因和IGF－1基因功能及优质肉羊的分子选育提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为新疆农垦科学院种羊场3只健康的6月龄萨福克公羔，屠宰后立即采集肠系膜淋巴结、心脏、肝脏、垂体、大脑、肾脏、骨骼肌、体侧部皮肤、肺脏、睾丸和脾脏11 个组织，立即置于液氮中速冻，－70℃保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

2×EasyTaq PCR SuperMix 购自全式金生物技术有限公司，E.Z.N.A.TM Total RNA Kit I购自美国Omega生物技术公司，Primer ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser购自宝生物工程（大连）有限公司，Light Cycler－Fast Start DNA Master SYBR Green I购自美国Roche公司。Light Cycler 2.0 荧光实时定量PCR 仪（美国Roche公司），Precellys 24 组织匀质器（法国Bertin公司），超微量紫外可见分光光度计（NanoPhotometer，德国Implen公司）。

1.3 引物设计与合成

以3－磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease，GAPDH）作为内标，根据杨华等［9］（2009）GAPDH 引物序列进行实时荧光定量PCR。以绵羊IGF－1 mRNA 序列（GenBank登录号：NM－001009774）和GH mRNA 序列（Gen－Bank登录号：NM－001009315）设计引物，引物序列见表1，由上海立菲生物技术有限公司合成。

表1 IGF－1、GH 和GAPDH 引物参数Table 1 Parameters of oligo－nucleotide primer pairs for the IGF－1，GH and GAPDH

1.4 RNA 提取和反转录

组织块0.5 mg经Precellys 24 组织匀质器研磨，按照E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit I试剂盒操作说明提取组织总RNA，总RNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用超微量紫外可见分光光度计测定总RNA 浓度和纯度。按照Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作说明对总RNA进行反转录。

1.4.1 总RNA 中基因组DNA 的去除 1μg 总RNA，2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O 补加至10μL，冰上操作并混匀，随后42 ℃水浴2min。

1.4.2 cDNA 的合成 上述反应液10μL 中加入1μL Primer Script RT Enzyme Mix I，1μL RT Primer Mix，4μL 5×Primer Script Buffer（for real time），4μL RNase Free dH2O，总体积为20μL。混匀后37 ℃反应15min，85 ℃灭活5s，4 ℃温育10s。RT 产物保存于－20 ℃备用。

1.5 目的基因的克隆

PCR反应体系为25μL，包括1.5μL cDNA 模板，12.5μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上游和下游引物（10μM）各1μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30s，合适的温度退火30s，72 ℃延伸30s，35个循环；72 ℃延伸5min。PCR 产物经琼脂糖凝胶回收，与pMD18－T 载体连接，并转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，PCR鉴定，阳性菌落提取质粒，送上海立菲生物技术有限公司测序。用DNAMAN6.0软件对测序结果进行同源性分析。

1.6 荧光定量PCR

用双蒸水以10倍梯度连续稀释的含目的片段的质粒作为荧光定量PCR 标准品，制作标准曲线。以反转录产物为模板，分别用IGF－1，GH和GAPDH基因的引物进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应体系为20μL：其组成为2μL cDNA，2.4μL Mgcl2（3mM），上游和下游引物（10μM）各1μL，2μL FastStar DNA Master SYBR Green I（10×）。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s，合适的温度退火10s，72 ℃延伸10s，45个循环；72 ℃延伸5 min；并进行融解曲线分析。每个组织样品检测做3次平行试验，取其平均值进行计算，并在每批次实验中设阴性对照，记录各样品的Ct值。

1.7 统计分析

样品设置相同的阈值线，以GAPDH 为内参基因进行标准化，用JMP 4.0（SAS Institute，2000）计算重复样品间Ct均值以及标准偏差，采用2－△△Ct方法处理数据［7］，分析基因相对表达差异量（△Ct＝Ct（目的基因）－Ct（内参基因））；萨福克羊不同组织间IGF－1和GH基因的差异表达采用SPSS11.5软件进行显著性分析，各组织目的基因表达丰度以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 RNA 提取与RT－PCR 结果分析

总RNA 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示清晰的28S 和18S 条带；经核酸蛋白分析仪检测，OD260／OD280＝1.8～2.0，提示RNA 完整性和纯度较好，可以进行后续试验。

2.2 绵羊IGF－1基因和GH 基因克隆测序结果

将GAPDH 基因、IGF－1基因和GH基因扩增片段克隆于pMD18－T 载体，经测序证明片段长度分别为149bp、251bp、119bp，目的基因大小与预期一致（图1－2），用DNAMAM6.0软件比对分析，证明克隆的基因分别为GAPDH、IGF－1 和GH基因，表明设计的引物能够正确扩增目的基因，可以用于IGF－1和GH基因的组织表达谱分析。

图1 GAPDH 基因电泳图1.空白对照；2～5.GAPDH PCR 产物；M.DL2000Fig.1 The agarose gel electrophoresis of GAPDH1.Negative control；2～5.PCR products of GAPDH；M.DL2000

图2 GH ＆IGF－1基因电泳图1，3.空白对照；2；GH PCR产物；4.IGF－1PCR产物；M.DL2000Fig.2 The agarose gel electrophoresis of GH ＆IGF－11，3.Negative control；2.PCR products of GH；4.PCR products of IGF－1；M.DL2000

2.3 扩增产物特异性分析

在SYBR Green I real－time PCR后进行熔解曲线分析，结果见图3。由图3 知，IGF－1、GH 以及GAPDH 基因的熔解温度分别为54 ℃、56 ℃和60℃，PCR 产物均呈一个特异性的峰，阴性对照无扩增产物，表明无引物二聚体和非特异性产物的形成，设计的引物有很好的特异性，目的基因得到较好的扩增。

2.4 绵羊IGF－1和GH 基因组织表达谱分析

图3 GH、IGF－1、GAPDH 基因熔解曲线Fig.3 The melting curve of GH、IGF－1、GAPDH

绵羊IGF－1和GH基因在11种组织中的相对表达量见图4。由图4可以看出，GH和IGF－1基因在绵羊11个组织中均有表达：其中GH基因在脾脏相对表达量最高，为1.12，其次是淋巴结和睾丸，三者的表达量差异未达到显著性水平（P＞0.05）；GH基因在脾脏、淋巴结、睾丸中的相对表达量显著高于心脏、肝脏、肾脏、大脑和骨骼肌（P＜0.05）；骨骼肌相对表达量最低，与肺脏中的表达量也存在显著差异（P＜0.05）。IGF－1基因在肝脏相对表达量为7.99，表达丰度最高，淋巴结次之，而在骨骼肌中相对表达量最低，仅为0.12；IGF－1 基因在肝脏和淋巴结中的表达量显著高于骨骼肌、大脑、肾脏、心脏、垂体、皮肤、肺脏、脾脏和睾丸9 个组织（P＜0.05），但在肝脏和淋巴结中的表达量差异不显著（P＞0.05）。

图4 IGF－1基因和GH 基因相对表达量Fig.4 IGF－1and GH gene relative expression

3 讨论

动物生长是一个极其复杂、高度综合的过程，不仅受神经内分泌调控，同时也受到营养水平、环境及基因型等多种因素的影响。一般认为GH－IGFs轴对动物生长发育有重要作用，GH－IGFs生长轴中，GH 先与其受体结合形成配体受体复合物，激发一系列生物反应使GH基因表达，继而再通过信号传递到IGF－1，然后促进IGF－1基因的表达，从而调控IGF－1的合成和释放，同时IGF－1则反馈抑制GH释放。通过这种反馈调节［11］或者存在一种自我调节机制［12］甚至是个体发育调节、内分泌因子调节及营养调节［13］，两者能够在机体内保持一个合理的浓度水平或表达丰度，最终维持机体正常的生长和生理反应。

总体看来，GH基因与IGF－1基因在绵羊各组织中两者的表达存在差异，GH基因不仅在萨福克羊的脾脏、淋巴结及睾丸中高表达，而且在其他组织器官也普遍表达，进一步说明GH基因对免疫系统、繁殖性能、生长发育等均起生物学作用，具有一因多效作用。IGF－1基因主要在肝脏高表达，淋巴结、脾脏等次之，这与Ichikawa等［10］的研究结果相似，说明IGF－1 基因对免疫系统、肝脏细胞生长等都有重要作用，也具有一因多效作用。说明肝脏不仅是该生长因子的主要合成器官，也是该基因特异性表达的组织器官之一。

由于动物机体不同组织中存在不同类型的GHR／IGF－1R 受体，不同组织中GHR 和IGF－1R表达量不同，甚至在不同组织中不同类型的GHR和IGF－1RmRNA 表达量也不同。Liu等［14］研究表明，猪肝脏中有1A 和1B2 种GHR mRNA，而肌肉、怀孕母猪卵巢及子宫只有1B 型GHR mRNA。Jiang等［15］研究发现，牛除了1A 和1B类型外，还存在GHR－1C、GHR－1D、GHR－1E、GHR－1F、GHR－1G、GHR－1H 和GHR－1I等7 种形式GHR mRNA。本试验利用荧光定量PCR SYBR Green I荧光染料法检测绵羊心脏、肝脏、肠系膜淋巴结等11个组织GH基因和IGF－1基因表达水平，证明GH基因和IGF－1 基因在睾丸、脾脏、肝脏、皮肤等11个各组织中均有表达，GH基因在绵羊脾脏、睾丸、皮肤、淋巴中高度表达，垂体、肾脏、大脑中中丰度表达，其余组织中低丰度表达；IGF－1基因在肝脏相对表达量较高，肾脏、大脑、垂体、肌肉、皮肤相对表达量较低，说明不同组织中不同类型的GHR 和IGF－1RmRNA 表达量影响GH和IGF－1基因的组织特异性表达。石子刚［16］报道GH基因参与脾脏发育及其功能的调节，本研究也证明GH基因在脾脏表达量较高，由于淋巴、脾脏均属于免疫器官，推测GH基因对免疫功能的改善有积极的作用。李发弟［13］研究表明GH 对动物初情期的启动、性成熟及精子发生和成熟有调节作用，本研究证明萨福克羔羊睾丸中GH 表达量较高，提示GH 可能参与了睾酮的合成调节。同时，GH基因在肺脏中也有较高丰度，提示GH基因与呼吸系统的发育有关。IGF－1基因在脾脏和肝脏中表达丰度较高，提示IGF－1同样参与绵羊脾脏的免疫调节，另外，Mateescu等［17］报道睾酮经IGF－1基因作用影响绵羊肌肉生长，推测该基因在生殖系统的的网络调控中发挥一定作用。相关研究表明，在妊娠早期和中期，胎盘中IGF－1基因表达变化会对妊娠后期胎儿发育产生影响［18］，不同日龄绵羊的GH和IGF－1 mRNA 水平存在差异［7，17］。

动物在不同生长阶段靶器官受体表达也存在差异［19－20］，动物饲喂不同类型的日粮能激活胰岛素信号通路与JAK2－STAT 通路中部分重要基因表达，导致基因的表达也随之而改变［11］，遗甚日粮营养水平不同，基因的表达丰度也有差异［8］。因此，不同组织器官、不同生长阶段、受体类型、品种、年龄及性别都会影响GH和IGF－1基因的组织特异性表达。

4 结论

GH基因在睾丸、肠系膜淋巴结和脾脏中呈高丰度表达；IGF－1基因在肝脏和肠系膜淋巴结中呈高丰度表达，GH和IGF－1基因存在组织表达的特异性和差异性。

GH基因在萨福克羊生长发育、免疫和繁殖性能中起作用，IGF－1基因也对萨福克羊生长发育及免疫发挥效应，GH和IGF－1基因均具有一因多效作用。

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