初步探究酶法制备草鱼鱼皮胶原蛋白ACE抑制肽

■ 雷亚君 唐亚丽 卢立新

（1.江南大学机械工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学中国包装总公司食品包装技术与安全重点实验室，江苏无锡214122；3.江苏省食品先进制造技术重点实验室，江苏无锡214122）

我国拥有非常广阔的水域，水产品资源丰富且其中富含胶原蛋白，但水产品的加工研究滞后。胶原蛋白是动物体内最多的蛋白质，良好的生物相容性及可生物降解性及低抗原性[1]，使之被广泛地用于食品及生物医学材料等领域中。由胶原蛋白水解得到的胶原肽有许多生理活性功能，例如ACE抑制肽、抗肿瘤肽以及抗氧化肽等[2]，所以以水产品为加工原料制备胶原肽有广阔的前景。

血管紧张素转换酶(Angiotensin converting I enzyme,ACE)能调节血压，当其受到抑制时，血压就会降低。Ferreira（1965）[3]在蛇的毒液中得到了ACE抑制肽,从此开启了ACE抑制肽应用的篇章。通过动物（高血压大鼠）和临床试验发现，口服或是静脉注射ACE抑制肽降血压效果都很好[4-7]。用于临床的合成ACE抑制剂易引起多种副作用，来自天然的ACE抑制肽则安全可靠,药物毒副作用小,且易吸收，是人们研究的热点。

ACE抑制肽主要通过酶法制得，然后用凝胶、反相色谱等方法分离纯化。由于有ACE抑制活性的肽类大多是寡肽，寡肽一般由2～6个氨基酸组成，分子量段一般在1 000 Da以下，所以要尽可能提高寡肽产物的含量。本试验考察了酶解产物的肽得率、相对分子质量分布和ACE抑制活性，比较四种酶对鱼皮胶原蛋白的作用效果，并选出最优酶种，得到最佳酶解条件。

蛋白酶是一类催化肽键水解的酶，它具有专一性，酶种不同，其酶的化学特性是不同的，导致某种蛋白酶可能只对某些肽键作用[8]。本试验用下面四种酶对鱼皮胶原蛋白水解：①A.S.1398蛋白酶，是从枯草杆菌中得来的食品级中性蛋白酶[9]，被广泛用于食品、医药等行业；②Alcalase 2.4 L，NOVO酶制剂公司的产品，食品级，已被广泛用于生物技术领域[10-13]；③Protease N，Amano酶制剂公司的产品，有较高的水解蛋白质的能力，其作用得到含 3～5个氨基酸短肽的酶解产物比例较高；④木瓜蛋白酶，从木瓜胚乳中得到，属于巯基蛋白酶,有较宽的底物特异性，能使蛋白质分子内部肽链-CO-NH-断裂，使之生成小分子量的多肽类，已被广泛用于医药、食品等行业[14]。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料和主要试剂

鱼皮胶原蛋白(试验室制备)、Protease N（日本天野酶制品株式会社）、A.S.1398中性蛋白酶（无锡杰能科酶制剂公司）、Alcalase 2.4 L[丹麦诺维信(NOVO)公司]、木瓜蛋白酶(上海生物试剂公司 )、血管紧张素转化酶(ACE)（美国Sigma公司）。

1.2 酶解鱼皮胶原蛋白

向恒温酶反应器中加入鱼皮胶原蛋白和水，搅拌，使之混匀。向反应器中加酶，通过 0.5 mol/l NaOH保持反应体系的pH值，用pH-stat法检测水解度。在反应结束后，用沸水浴灭酶15 min。在冷却后离心30 min，取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥。

1.3 蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)的测定

采用pH-stat法检测水解度[15]。

1.4 相对分子质量分布的测定

仪器：Waters 600高效液相色谱仪；色谱柱：TSK-gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；检测：UV220 nm；流速：0.5 ml/min；柱温：30℃。将干燥后的鱼皮酶解产物配成0.5 mg/ml的浓度；进样体积：20 μl。

1.5 测定酶解产物ACE抑制活性

采用色谱法测定ACE的活性，参照 Shu Hua Xia[10]中的方法。

色谱条件：HPLC系，美国Waters公司；色谱柱：Sun-FireTM C18 ODS（150 mm×4.6 mm），美国 Waters公司；流速：1.0 ml/min；检测波长：228 nm；进样量：10 μl；柱温：30 ℃；流动相：12%乙腈（含 0.05%乙酸）。

2 结果与讨论

2.1 不同酶对鱼皮胶原蛋白的水解

在酶与底物浓度比([E]/[S])为相同（3 000 U/g）的情况下，通过肽得率比较几种蛋白酶在各自最适的情况下对鱼皮胶原的酶解效果(见表1)。

表1 几种酶对鱼皮胶原酶解效果比较

由表1可知，水解鱼皮胶原肽得率最高的是Protease N和A.S.1398，其酶解效果优于另外两种蛋白酶，所以选择这两种酶水解鱼皮胶原。

2.2 酶解产物的相对分子质量

酶的作用位点是不同的，所以即使在水解度条件相同的情况下，其产物的相对分子质量分布也不同。蛋白质可以通过两种形式被吸收，即肽和氨基酸。肽与游离氨基酸运输方式不同，肽的吸收高效迅速，特别是寡肽[11-12]；而高渗透性的游离氨基酸易导致腹泻[13]。肽链中氨基酸残基的数目对活性有很大的影响[16-17]。因此，相对分子质量的含量是酶解产物需要考虑的指标。

表2所示是当水解度为16%时，两种酶对鱼皮胶原蛋白酶解作用产物的相对分子质量分布和游离氨基酸的含量。由表2可知，当水解度相同时，A.S.1398的酶解产物中，分子量800～150 Da的比例达到72.36%，而分子量小于150 Da的仅占0.94%，所以寡肽较多，游离氨基酸较少。故得出，A.S.1398对鱼皮胶原水解的作用效果较好。

表2 鱼皮胶原蛋白酶解产物的相对分子质量分布和游离氨基酸的含量

2.3 酶解产物的ACE抑制活性

测定两种酶解产物的ACE抑制率，两种酶解产物浓度均为1.5 mg/ml(见图 1)。

图1 两种酶解产物的ACE抑制率与水解度的关系

由图1可知，水解度相同时，A.S.1398酶解产物的ACE活性较高，且随着水解度(DH)升高而增加，可能是由于酶对底物的特异性以及作用位点的不同所造成的。一般情况下，较小分子量的肽有ACE抑制活性，这与表2的结果也是一致的。

2.4 影响A.S.1398水解鱼皮胶原蛋白的因素

2.4.1 底物浓度的影响

底物浓度对酶解反应有着重要的影响，酶与底物的结合随着底物浓度的增加而增多，从而提高反应速率。在酶解温度为50℃，6%的A.S.1398加入量，在pH值为7.0情况下，观察底物浓度对水解度的影响(见图2)。

图2 不同底物浓度对A.S.1398水解鱼皮胶原蛋白的影响

由图2可知，在3个底物浓度中，A.S.1398于浓度为5%时对鱼皮胶原的水解作用是最好的，底物浓度增加到7%时，水解度反而下降了。这说明底物抑制现象会在鱼皮胶原蛋白的酶解过程中产生，所以较适宜的底物浓度为5%。

2.4.2 酶解温度的影响

在底物浓度[S]为5%，酶与底物浓度比([E]/[S])为6%，且pH值为7.0的情况下，研究酶解温度对水解度的影响(如图 3)。

图3 不同酶解温度对A.S.1398水解鱼皮胶原蛋白的影响

图3中显示，3个酶解温度中，A.S.1398于50℃时对鱼皮胶原的水解效果是最好的。随着酶解时间的增长，水解度显著升高。但在55℃时，DH数值反而降低了。所以，A.S.1398酶解鱼皮胶原的较适宜温度在50℃左右。

2.4.3 pH值的影响

pH值的影响是多重的，不仅对酶的稳定性，对酶与底物的结合以及酶催化底物转变为产物也有作用。在底物浓度为5%的情况下，加酶量为6%，酶解温度为50℃，观察此时不同pH值对水解度的影响(见图4)。

图4 不同pH值对A.S.1398水解鱼皮胶原蛋白的影响

由图4可知，在3个pH值中，A.S.1398于pH值在6.5时对鱼皮胶原的水解作用是最好的，水解度随着反应液的pH值的升高而下降。所以，pH值6.5是A.S.1398水解鱼皮胶原蛋白最适宜的pH值。

2.5 鱼皮胶原蛋白酶解产物的组成分析

由以上确定最佳酶种为A.S.1398，最优酶解条件为：酶解温度为50℃，底物浓度为5%，pH值为6.5。在此情况下对鱼皮胶原作用，其酶解产物的相对分子质量分布见表3。由表3可知，分子量为800～150 Da所占比例高达72.48%，所以酶解产物中含寡肽较多。

表3 鱼皮胶原蛋白酶解产物的相对分子质量分布

3 结论

在本试验中，考察了酶解产物的肽得率、相对分子质量分布和ACE抑制活性这三个方面。由试验得出，在四种酶中，A.S.1398是水解鱼皮胶原蛋白的最佳酶种，其最优酶解条件为：酶解温度50℃，底物浓度5%，pH值6.5，此时得到ACE抑制性较好的胶原蛋白肽。与合成药物相比，天然来源的ACE抑制活性肽安全可靠，药物副作用小，是人们研究的热点。今后应进一步对鱼皮胶原蛋白ACE抑制肽进行分离纯化并研究其作用机理，为渔业资源的综合开发利用提供技术支持。