不同处理条件对饲料和鱼肌肉中游离肉碱含量的影响

■葛晨霞 王秋举 董晓庆 陈玉珂 张东鸣

（吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118）

L-肉碱作为一种水溶性类维生素的新型功能性添加剂在水产饲料行业应用广泛，它具有促进水产动物生长、提高饲料利用率、抗应激等多方面的生理作用。目前，L-肉碱也被视为一种营养保健产品和减肥产品，广泛应用于食品行业和制药行业，其保健功能越来越受到人们的重视[1]。由于水产动物摄食的特点和L-肉碱易溶于水的特性，添加到饲料中的L-肉碱在水体中浸泡的时间是否会有溶失[2]，以及水煮处理是否会对鱼类肌肉中L-肉碱造成损失等问题国内外相关研究较少。本研究通过两个试验，研究了不同处理条件对鱼类肌肉和饲料中游离肉碱含量的变化，为尽可能减少鱼肌肉在烹饪及饲料投喂过程中L-肉碱损失，最大程度被人体和水产动物所吸收利用，最大程度发挥肉碱的营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲料

本试验选择6种优良淡水鱼：草鱼（草食性）、鲢鱼（滤食性）、鲤鱼（杂食性）和鳜鱼（肉食性）、鲶鱼（温水鱼）、虹鳟（冷水鱼），2013年7月购自长春市新城大街农贸市场，均为个体中等偏大的鲜活鱼。设置水煮时间为5、15 min组和30 min组，每组3重复。

以鱼粉为蛋白源，根据Fucxen[3]鲤鱼饲料的最适L-肉碱添加量为100～400 mg/kg，确定在本试验饲料中添加L-肉碱量为200 mg/kg。将空白组饲料和肉碱组饲料分别置于蒸馏水中浸泡10、30 min和60 min，每组3个重复。

1.2 试验方法

1.2.1 水煮方法

参照杨铭铎等[4]方法，略作修改。称取清洗沥干的生鱼肉20 g置于已煮沸的装有500 ml蒸馏水的烧杯中，于电炉上进行水煮，从煮沸时(水温100℃)开始计时，采用继续加热水煮5、15、30 min。水煮过程中添加100℃蒸馏水确保体系总质量不变，冰水浴急速冷却至室温。肉块取出后立即放置冰块上，用滤纸吸干表面水分，冷却后装入自封袋，置-80℃冷冻备用。

1.2.2 饲料制作

按照生产工艺包括配料、粉碎、搅拌、混匀、熟化、调质、制粒、包膜、冷却、干燥等过程（各饲料原料经粉碎后过60目筛，按配方称重、采用逐级扩大的方法均匀混合，用小型制粒机加工成直径为2.5 mm的颗粒，晾干）制作的颗粒饲料，晾干后置于-20℃冰柜中保存、备用。饲料配方及营养成分见表1和表2。

表1 试验的饲料配方(%)

表2 试验的基础饲料的营养水平

1.2.3 饲料浸泡

参照陈四清等[5]及郭沛涌等[6]方法，略作修改。考虑操作条件对L-肉碱测定的影响，试验采用蒸馏水静止浸泡，以保证试验条件的一致。准确称量10 g颗粒饲料（精确至0.000 1 g），置于自制圆筒形300目网筛中，浸于内盛400 ml蒸馏水的烧杯中，在水浴锅中，于水温25℃条件下保持恒温，分别浸泡10、30、60 min，然后用镊子轻轻夹取，收集残留饲料，晾干，于105℃烘干，冷却后，放置于干燥器中保存，备用。

1.2.4 样品前处理

鱼肉、饲料中游离肉碱的提取参照Miyasaki等[7]方法，略作修改。准确称取鱼背肌和饲料0.3 g，于精密离心管中。加入3 ml的6%高氯酸溶液和0.02 mol/l 2-巯基乙醇混合液，用超声波破碎仪匀浆1 min。4℃条件下5 000 r/min离心10 min。收集上清液。重复以上操作，合并两次上清液A，用精密试管记录体积，一部分上清液A（留出2次备用体积）用3 mol/l的K2CO3和0.5 mol/l三乙醇胺混合液中和（pH值7.5），然后5 000 r/min离心10 min，收集上清液C。上清液C用0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.2.5 酶解处理

处理后样品中按顺序分别加入乙酰CoA（0.000 1 mol/l）25 μl，磷酸缓冲液（0.01 mol/l）300 μl，EDTA（0.001 mol/l)100 μl，CAT(1.3 U)20 μl(空白试验)加入KH2PO4（0.01 mol/l）20 μl，2-巯基乙醇（0.01 mol/l）55 μl，进行酶反应试验和空白试验，反应混合物在25 ℃培养30 min，加入0.1 ml磷酸（11 mol/l）终止反应。反应混合物用0.45 μm滤膜过滤，记录体积。用HPLC测定鱼肉中肉碱含量[8]。

1.2.6 HPLC色谱条件

色谱柱:Cosmosil 5C18-AR(4.6 mm×250 mm);紫外检测波长254 nm；流动相:KH2PO4(0.190 mol/l)∶meth⁃anol(甲醇)=80.5∶19.5(v/v)；流速：0.7 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μl；分析时间：初设为15～20 min。

1.2.7 标准曲线制作及游离肉碱含量计算

精密称取L-肉碱标准品，加流动相配制成0、20、40、60、80、100 μg/ml的梯度溶液，进行酶反应试验和空白试验，在上述色谱条件下进行分析，以出现的CoASH峰面积为纵坐标，相对应的肉碱标准溶液浓度为横坐标，作标准曲线，计算R值，写出曲线方程为：Y=aX+b，根据设定的浓度和对应的峰面积计算出a、b值。

式中：Y——代表曲线的浓度；

X——对应浓度的峰面积。

样品提取液和L-肉碱标准曲线分别按设定的色谱条件进行分析，根据两种溶液峰面积值计算样品中L-肉碱的含量（mg/g），公式如下：

式中：Ci——样品中L-肉碱的含量（mg/g）；

Cs——根据标准曲线得出的L-肉碱浓度(mg/ml);

V——样品提取液总体积（ml）；

m——样品质量（g）；

161.2——肉碱分子量。

1.3 仪器和设备

LC-2010高效液相色谱仪，AUY220电子天平（感量 0.000 1 g）（日本岛津）；色谱柱Cosmosil5C18-AR 4.6×250 mm（上海生工）；SONICS细胞破碎仪(USA)；水平振荡器、离心机（德国艾本德）；单道可调移液器（德国EPPENDORF公司）；自动颗粒制冰机（江苏太仓华美生化仪器厂）；GM-0.33隔膜真空泵（天津市腾达过滤器）；DK-8D电热恒温水浴（上海精密实验设备有限公司）；pH酸度计DELTA320（梅特勒）；饲料膨化机DGP-010II（河北裕工）；2.2 kW绞肉机（河北）；HD-25型转鼓式添加剂混合机，自制圆筒型筛网，粉碎机JFSD-100III（上海嘉实）。

1.4 数据统计

表中所有试验结果均表示为“平均值±标准误”(n=3)。采用单因素方差分析(ANOVA)，当处理组之间存在显著性差异(P＜0.05)时，用Duncan's法进行多重比较分析。所有统计分析均采用SPSS 16.0软件和Excel 2003进行分析。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

本试验选择了0、20、40、60、80、100 μmol/l 6个肉碱标准浓度，上机测定后得到其峰面积（见表3）。以峰面积差为纵坐标，肉碱标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图1）。

表3 不同浓度肉碱标准品对应的峰面积差

图1 肉碱标准曲线

2.2 浸泡时间对饲料中游离肉碱含量的影响

不同的浸泡时间对饲料中L-肉碱的影响情况见图2。由图2可知，添加L-肉碱的鲤鱼饲料在水中浸泡的时间不同，其所含的L-肉碱数量不同。随着浸泡时间（0～60 min）的不断增加，浸泡过后的鲤鱼饲料中L-肉碱浓度（1.83～0.87 μmol/g）呈现逐渐下降的趋势。其中浸泡60 min组饲料的L-肉碱含量最低(0.87 μmol/g)，其次是浸泡30 min组饲料(0.99 μmol/g)，浸泡10 min组饲料（1.44 μmol/g）。与对照组相比，浸泡10 min组饲料、浸泡30 min组饲料和浸泡60 min组饲料的L-肉碱含量均显著降低（P＜0.05），而10 min组饲料中L-肉碱含量显著高于浸泡30 min组饲料和浸泡60 min组饲料的L-肉碱含量（P＜0.05），浸泡30 min组饲料中L-肉碱含量显著高于浸泡60 min组(P＜0.05)。

图2 浸泡时间对添加肉碱的鲤鱼饲料中肉碱含量的影响

2.3 不同水煮时间对6种不同食性鱼类肌肉中肉碱含量的影响

取草鱼、鲤鱼、白鲢、鲶鱼、虹鳟和鳜鱼的背大肌，分别水煮5、15、30 min。按照1.2.6中的 HPLC色谱条件得到肉碱出峰时间和峰面积，根据标准曲线和公式计算肉碱含量（见表4）。由表4可见，不同水煮时间对前5种鱼背大肌中L-肉碱含量均有明显的影响，而对鳜鱼无明显影响；同时可知不同水煮时间对不同鱼类背肌中L-肉碱含量的影响存在差异，但趋势均是随着水煮时间的增加含量逐渐减小。

表4 不同的水煮时间对6种鱼背大肌肉碱含量的影响(μmol/g)

2.4 不同水煮段内6种不同食性鱼类肌肉中游离L-肉碱溶失的平均速率的变化

本研究中，6种不同食性鱼类肌肉中游离L-肉碱溶失的平均速率在不同的水煮时间段内变化趋势见图3。由图3可知，在30 min的水煮时间内，三个时间段内，鱼背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率的变化情况并不完全相同。分析可知，6种不同食性鱼背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率的变化趋势可分为三种，一种是先升高后降低，如鲶鱼、白鲢；另一种是逐渐降低，如鲤鱼、草鱼、鳜鱼；还有一种是先降低后升高，如虹鳟。

图3 不同水煮时间段内6种不同食性鱼类肌肉中游离L-肉碱溶失的平均速率变化趋势

3 讨论

自从肉碱被第一次发现（1905年）至今已有100多年的历史，其基本的生理功能为促进机体脂肪酸代谢，加速细胞基质中脂肪酸进入线粒体进行氧化，为机体提供更多能量。同时，肉碱还是孕妇、新生婴儿的必需营养物质，对老年人心脏病、心血管疾病等也能起到预防作用。因此不仅对于这些特殊人群（孕妇、婴儿、老年人、运动员、肥胖者、病人等），肉碱是一种必需的营养素，就是对于正常人群，满足体内肉碱的需要对健康是非常有意义的。人体内肉碱来源于两个途径，一个途径是体内自身的合成，另一个途径是从食物中摄取。Ilhami Gulcin（2006）[9]发现人体内肉碱有25%来源于体内合成，75%来源于食物当中。在日常的饮食中，各种食物肉碱的含量不尽相同。Sheenan Harpaz[10]研究报道，鲜肉类食品肉碱最高（500～1 200 mg/kg），其次是鱼类，再是鸡肉和奶制品（16～64 mg/kg），而蔬菜、水果等植物性食品中肉碱含量最少（＜0.5 mg/kg）。由此可知，鱼类是一种在日常饮食当中肉碱含量较高的来源，合理的烹饪调质，最大可能地吸收鱼类当中的肉碱具有重要意义。

本研究结果表明,游离L-肉碱水平依次为滤食性的白鲢(2.06 μmol/g)最高，草食性的草鱼(1.36 μmol/g)次之，其次是肉食性鱼虹鳟(1.27 μmol/g)、鳜鱼(1.04 μmol/g)、鲶鱼（0.81 μmol/g），最少的是杂食性鲤鱼（0.73 μmol/g）。这一试验结果与理论上推断存在差异，原因可能有以下两方面：第一，鱼肌肉中L-肉碱的存在形式有两种，一种是游离型L-肉碱，另一种是酯化型L-肉碱，两者之和称之为总的L-肉碱含量。本试验所测得的只是游离型L-肉碱浓度，酯化型L-肉碱浓度未测得，所以推测肉食性鱼背肌中L-肉碱更多的是以酯化型L-肉碱的形式存在，而滤食性鱼和草食性鱼背肌中L-肉碱更多的是以游离型L-肉碱的形式存在。第二，试验鱼的年龄、饲料（L-肉碱水平）、饲养环境等均会不同程度地影响L-肉碱在机体内的沉积，而本试验所用的试验鱼均是购于市场，其详细情况并不清楚，这也可能是造成这一结果的原因。

Caroline Rigault等[11]研究了不同的家庭烹饪方式对鲑鱼中肉碱含量（包括游离肉碱）的影响，结果显示：除了熏制处理会显著降低鲑鱼的肉碱水平，其它处理（煎炸5 min、水煮5 min、烧烤10 min、烘烤10 min、微波炉加热2 min、蒸煮5 min、冷冻保存1～6月）均未显著降低鲑鱼肉碱水平，其中熏制处理造成肉碱显著降低，其中游离肉碱浓度几乎未变，这说明熏制处理使酯化型肉碱降低，多游离型肉碱并未造成影响。本试验结果表明，草鱼、白鲢、鳜鱼、虹鳟4种鱼在水煮5 min时，肌肉中肉碱浓度均未显著降低，与Caroline Rigault等[11]研究结果一致。

按照中国人的饮食习惯，通常情况下均是将生鱼经过高温处理后才会食用，例如，煎炸、煲汤、熏制等加工处理，而肉碱是一种极易溶于水的类似维生素的营养物质，鱼肌肉中肉碱在水煮处理条件下，随着肌肉细胞被破坏而游离出细胞溶解在水中。这是否会对鱼类中肉碱造成损失，相关的报道较少。本研究设置了5、15、30 min的水煮时间，探讨水煮处理对鱼肉中肉碱含量的影响。试验结果表明，水煮处理会造成鱼肌肉中肉碱含量不同程度的减少。在试验期间，水煮时间对鳜鱼中肉碱无显著影响，其余5种鱼类均有显著影响。鲤鱼和鲶鱼在水煮5 min时肌肉中肉碱含量就显著降低，而草鱼是在水煮15 min时才显著降低，白鲢和虹鳟是在水煮30 min时肌肉中肉碱含量才显著降低。由此可知，不同食性的鱼背肌中游离L-肉碱在相同的水煮时间条件下溶失的平均速率不同，在水煮0～5 min时间内，鲤鱼背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率最大；在水煮5～15 min内，白鲢背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率最大；在水煮15～30 min内，虹鳟背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率最大。通过对比可知，在水煮30 min内，6种不同食性鱼背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率的变化趋势可分为三种，一种是先升高后降低，如鲶鱼、白鲢；另一种是逐渐降低，如鲤鱼、草鱼、鳜鱼；还有一种是先降低后升高，如虹鳟。造成这一结果的主要原因可能是由于鱼种类所致，不同种类的鱼，其背肌肌纤维结构可能存在，对温度的敏感程度也不同，所以导致不同食性鱼在相同的水煮处理条件下，其背肌中游离L-肉碱溶失的平均速率存在差异。

在水煮30 min条件下，未检测到鲤鱼背肌中肉碱水平，这可能是由于水煮15 min时，鲤鱼肌肉中游离L-肉碱已经降低了88%，又经过15 min的水煮处理，肌肉中剩余的12%肉碱全部溶于水中，所以未能检测出水煮30 min时鲤鱼背肌肉碱的含量。水煮处理（0～30 min）鳜鱼背肌中游离L-肉碱含量未显著降低，产生这一现象原因可能是鳜鱼背肌细胞对水煮处理不敏感，而更有可能的原因是，鳜鱼背肌中L-肉碱更多的是以酯化型肉碱形式存在的。至于水煮加热处理对不同食性鱼肌肉中L-肉碱溶失规律的机理还有待于进一步的研究。

水产动物其摄食方式有别于畜禽，其生活的环境是在水体中，饲料必须要投入到水中才能被水产动物所摄食，而且投入水体的部分颗粒饲料不能及时被水产动物摄食，需要在水中浸泡一段时间才能被动物摄食。正是由于这些方面的差别就要求水产颗粒饲料在水中能保持一定稳定性，即饲料经投喂后在水中受到水流的冲击和浸泡，能再一定时间内保持饲料组分不被溶解及饲料不散失的性能。适量的肉碱添加能提高养殖业的经济利益，但是肉碱是一种易溶于水、易吸潮的物质，它的溶解性导致饲料中肉碱势必要有一定程度的溶失。本试验结果表明：在浸泡0～10 min时间范围内，饲料中肉碱含量减少了21.31%，而在10～30 min这20 min的浸泡时间内，饲料中肉碱含量减少了24.59%，在30～60 min这30 min的浸泡时间内，饲料中的肉碱减少了6.56%。这说明，鲤鱼饲料中肉碱的溶失主要集中在浸泡水中前30 min，期间肉碱溶于水体中的量为45.90%。饲料在水中浸泡超过30 min后，肉碱溶解相对减少。

通过对以上数据的分析可知，鲤鱼饲料中肉碱含量在投入水中30 min内减少较大，尤其是在水中浸泡的前10 min，饲料中肉碱溶失最快。朱伯清等[12]试验结果表明，颗粒饲料在水中浸泡的稳定性一般不超过30 min时，水中饲料损失率可达40%以上。通常虾、蟹的摄食时间是在投料后约2 h可摄食完全；而鱼类的摄食时间是在20～30 min内，甚至有些鱼类投料15 s内即可摄食完全。所以笔者建议，在实际的生产实践过程中，应该采用少量多次的投喂方式。因为如果一次性投入较多的饲料而不能全部被鱼类所摄食，剩余的饲料势必就要在水中浸泡一段时间才能被采食，饲料在水中浸泡的时间内必将引起饲料中肉碱水平的降低，从而减少了水产动物摄食肉碱的含量，降低了鱼类的生长性能和抗应激能力，影响了鱼类的健康生长，进而造成经济损失。陈四清等[5]研究表明，如缺乏水溶性维生素类营养物质，则会引起鱼、虾蛋白质的消化吸收，长期缺乏则会引起抵抗力下降、组织出血、甚至死亡等症状。总而言之，准确的控制投饲技术比较重要，投饲技术是保证饲料中肉碱不被浪费的关键。

浸泡时间是饲料中肉碱含量溶失的主要因素，而肉碱溶失的速率还与饲料本身的物理性质有一定的关系。如饲料的稳定性，而饲料的稳定性又是由诸多因素所决定的，如：黏合剂的使用，饲料加工技术与工艺，原料本身的性质等。

4 结论

在本试验条件下，水煮处理对白鲢、草鱼、虹鳟、鲶鱼、鲤鱼5种鱼背肌中游离L-肉碱含量均显著降低，对鳜鱼鱼背肌中游离L-肉碱含量无明显影响；不同食性的鱼背肌中游离L-肉碱溶失速率变化趋势不同。随着浸泡时间的不断增加，鲤鱼饲料（添加200 mg/kg L-肉碱）中游离肉碱含量逐渐减少，在浸泡前30 min内，饲料中肉碱溶失量最大。