中药抗肝癌血管生成作用研究进展*

盛庆寿 王 武

广西中医药大学附属瑞康医院(广西 南宁，530011)

原发性肝癌按组织学分类可分为肝细胞癌(HCC)、胆管细胞癌(CC)和混合型肝癌，其中以HCC 最为常见，是全球第五大常见肿瘤，死亡率排在第三位［1］。肝癌起病隐蔽，大多数肝癌患者确诊时已处于肝癌晚期，已经不能接受外科手术治疗。在传统中医学中肝癌属于“积聚”、“癥瘕”、“鼓胀”等病范围，中医肿瘤界发展了“癌毒”概念，认为正气虚损是原发性肝癌发生发展的内在因素，癌毒内生是原发性肝癌发生发展的病理基础，“癌毒”是恶性肿瘤发生发展、浸润转移最根本的因素［2］。而现代医学认为肝癌的发生是一个多因素、多步骤的生物学过程，肝癌细胞的增殖、侵袭需要依赖新生血管。血管的生成与肝癌的生长、浸润和复发均有明显的相关性。随着中药现代化的发展，传统中药中所筛选的低毒、有效的抗肝癌活性成分成为当前研究的热点。笔者将就中药及中药提取物通过抑制肝癌血管生成抗肝癌方面的研究予以探讨，并就其抗肝癌血管生成机制研究进展进行综述。

1 肝癌与血管生成

肝癌是典型的富血管肿瘤，血管生成作用在肝癌生长中最为典型［3］。在肝癌细胞生长的前期，其仅能够依靠周围组织弥散的营养物质来维持生长，肿瘤生长较为缓慢，极少发生转移。当其直径超过2mm 时，随着肝癌细胞需氧量的增大，而原有扭曲扩张的血管在运输血液上效率很低，内部供血不足，很容易缺氧，氧的不足会抑制癌基因的表达或抑癌基因的失活，肝癌细胞必须要形成供给自身的血管。因此为了进一步增殖其激活了血管生成促进因子，诱导内皮细胞的激活、增殖、迁移并生成新的血管［4］。这些新生血管的内皮细胞相比于正常血管内皮细胞具有更强的血管生成能力和药物抵抗能力，而且血管生长分布往往不规则，具有异常的血液流动和过多的渗漏，无正常的血管功能。这种异常的血管改变最典型的表现是引起微脉管系统动脉化和毛细血管化［3］，帮助肿瘤组织更快速的生长、浸润。肝癌血管生成是一个复杂的过程，涉及多种血管生成调控因子间相互协调，以及一些小分子物质和基因表达的改变，从而促进内皮细胞激活、基底膜降解、增殖、迁移、管道化，形成新的毛细血管网［5］。血管生成调控因子是促进或者抑制血管形成的一类天然物质，在肿瘤血管生成过程中起着主导作用。其种类非常多，当前研究较多的包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子 (transforming growth factor，TGF)、肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor，TNF)-α、环氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2 等。Hanahan等［6］在1996年提出“血管生成开关”(angiogenic switch)的概念，认为肿瘤中与血管生成相关的抑制因子和促进因子之间的平衡被打破是肿瘤血管生成的关键。当前临床上使用的抗血管生成类靶向药物主要分为两大类:单克隆抗体如贝伐单抗，贝伐单抗能与人VEGF 结合并阻断其生物活性而用于多种癌症的治疗;另一类为酪氨酸激酶抑制剂，代表药物是索拉菲尼。索拉菲尼是一种多靶向的激酶抑制剂，其主要通过阻断Ras-Raf-MAPK 通路直接抑制癌细胞的生长和转移［7］。这类药物虽然能在一定程度上起到抑瘤作用，延长晚期肝癌患者生存时间，但是都不可避免出现耐药现象，疗效并不持久［8，9］。

2 中药抗肝癌血管生成的研究

中医药疗法治疗肝癌时来已久，在肝癌特别是晚期肝癌的治疗中，中医中药与外科手术、介入治疗、放化疗相结合可明显提高抗癌疗效，减少不良反应，预防肿瘤复发，这已得到学术界的广泛认同。并且多种中药及中药提取物、中成药、中药复方制剂都显示了较好的抗肝癌作用，在临床上得到使用。近年的研究表明，某些中药及中药提取物或复方制剂通过抑制肝癌血管生成，表现出较强的抗肝癌生长作用，其中部分药物的抗血管机制已经得到明确。目前认为这些药物主要通过以下几个方面对肝癌血管生成进行调控。

2.1 调控血管生成调控因子 在中药及其提取物抗HCC 血管生成方面，当前研究的较多的血管生成调控因子是VEGF、MMP 及其他因子。

2.1.1 下调VEGF 表达 VEGF 及其受体VEGFR -1、VEGFR-2、VEGFR-3 等是目前发现最重要的一类血管生成调控因子，受体与VEGF 的结合后发生自身磷酸化，诱发一系列信号传导，而在肝癌的血管生成中起着关键作用［10］。其促血管生成机制涉及加速血管内皮细胞增殖和分化、促进MMP 产生、增强NO 合酶(NOS)表达等。VEGF 是多种肝癌血管生成抑制剂的干预靶点，也是目前研究的热点。猫人参根是一种广泛用于HCC 治疗的传统中药，Guo 等［11］将其分离提取物(total saponin from root of Actinidia valvata Dunn，TSAVD)作用于H22肝癌细胞和H22 肝癌大鼠模型，发现TSAVD 处理组的肿瘤体积和血管密度都较其他组更小。通过图像分析系统定量分析提示，TSAVD 处理组的bFGF 表达低于对照组，其中高剂量组的bFGF 表达较低剂量组低，同时高剂量组的VEGF 表达也和其余两组具有差异性。提示猫人参根通过下调VEGF 和bFGF 表达而具有显著的抗HCC 血管生成作用。青蒿琥酯是从菊科艾属植物黄花蒿中分离出来的活性成分，临床上用于抗疟治疗，但近年研究发现其具有较强的抗肿瘤作用。盛庆寿等［12］用免疫组化法观察青蒿琥酯对H22 荷瘤小鼠肿瘤组织VEGF 表达，发现青蒿琥酯具有下调肿瘤组织VEGF 表达的作用，从而认为青蒿琥酯的抑瘤作用与下调VEGF 表达有关。Shirakami 等［13］发现儿茶素通过抑制HCC 细胞VEGF-VEGFR 轴而实现抗HCC血管生成作用，研究发现儿茶素能明显降低HCC 细胞的VEGFR-2 和VEGF 水平，其机制可能是儿茶素对ERK 和Akt 蛋白激活的抑制减少了VEGF mRNA 表达、VEGF 的产生和VEGFR-2 激活，这种抗血管生成机制也在一项对EF24 (一种姜黄素类似物)［14］的研究当中被提出。Jie 等［15］对黄连素的研究还发现，黄连素不仅能抑制HCC 细胞的VEGF 分泌和VEGF 基因转录，在实验中还观察到这种抑制作用同时影响到人脐静脉内皮细胞的增殖、转移和血管形成，可能也影响到HCC 细胞和血管内皮细胞之间可能存在的某种联系，从而发挥其抗HCC血管生成的作用。

2.1.2 下调MMP 表达 MMP 是一个蛋白水解酶大家族，TIMP 是MMP 的特异性抑制剂，两者之间的平衡关系主要影响细胞外基质的降解代谢，在肿瘤细胞浸润、转移、增殖等方面起着重要的作用。同时MMP 也是一类重要的血管生成调控因子，其降解细胞外基质的作用，为内皮细胞的移行创造条件，也会促进肿瘤血管生成。MMP 家族被研究的最多的是MMP2和MMP9。

较多学者研究MMP 在中药及中药提取物抗HCC 时的变化，并将MMP 列为血管生成的一个观测指标。人参皂苷是源自中药人参中的一种活性成分，人参皂苷compound K (CK)是一种源于人参皂苷Rb1、Rb2、Rc 的人体肠道菌代谢产物［16］。Ming 等［17］的研究发现，CK 处理组的人肝癌细胞株MHCC97-H 相对于处理组，除了显著地抑制细胞集落形成，抑制细胞粘附、侵袭、转移能力外，通过明胶酶谱检测和蛋白质印迹法还发现其中MMP2、MMP9 表达水平明显降低，同时发现对NF-KB P65 核易位的抑制表明MMP 表达的抑制作用可能和NF-KB 信号的激活有关。青蒿素能打破人肝癌HepG2 细胞系的MMP-TIMP 平衡，而对细胞的转移、侵袭力、细胞周期转换起明显抑制作用［18］。此外，苦参碱也被发现具有类似机制［19］。由于MMP 在肿瘤血管生成过程中的重要性，提示了这些中药提取物或许同样具有潜在的抗HCC 血管生成作用。

2.1.3 对其他血管生成调控因子的调控 此外，扶正抑瘤颗粒［20］和姜黄素［21］能显著提高HepG2 细胞内TNF-α 水平。染料木黄酮对HepG2 细胞内的COX-2 和VEGF 表达能起到抑制作用［22］，这可能和染料木黄酮对Akt 通路和核因子kB (nuclear factor of kB，NF-kB)的抑制有关。

2.2 调控血管生成调控因子上游因子 肿瘤血管生成因子上游因子能通过对某些血管生成调控因子如VEGF 的调控，间接发挥其抗肿瘤血管生成作用。中药及中药提取物抑制HCC 血管生成的研究中，涉及的血管生成上游因子主要有信号传导与转录活化因子3 (STAT3)和NF-kB 两大类。

2.2.1 抑制STAT3 活性 STAT3 是一个关键的信号传导与转录激活蛋白。近年来，对STAT3 信号通路在肝癌的发生发展中的作用越来越受到重视，较多的研究表明STAT3 传导通路可以调控肝癌血管的生成［23，24］，而最近的研究也表明很多中药提取物都可能通过调控STAT3 信号通路途径发挥良好的抗肝癌血管生成作用，并对STAT3 的抗肝癌机制进行了相关研究。Rajendran 等［25］发现厚朴酚通过对STAT3 上游激酶c-Src、杰纳斯活化激酶(Janus Activated Kinase，JAK)1，JAK2 的抑制作用，在抑制HCC 细胞内STAT3 的诱导激活方面具有时间和剂量的依赖性。而下调的STAT3 活性和其引起的酪氨酸磷酸酶SHP-1 的表达有关。STAT3 的抑制导致了参与HCC 细胞增殖、存活、血管生成的各自基因产物受到抑制，提示其潜在的抗肝癌及其他癌症作用。相似的结论同样出现在对吴茱萸碱［26］、β-七叶皂苷［27］的研究中。Peramaiyan 等［28］对南蛇藤醇的研究进一步表明，南蛇藤醇可能在STAT3 的酪氨酰磷酸化过程中阻断了Src 和JAKs 的协同作用。同时观察到其对核转运和EGF (表皮生长因子)诱导的STAT3 活性以及几个受STAT3调控 的基因如细胞增殖(cyclin D1)、抗凋亡基因产物(Bcl-2，Bcl-xL，survivin，Mcl-1)和血管生成基因产物(VEGF)具有抑制作用，表明南蛇藤醇的抗肝癌作用是通过了多种机制进行的。此外，Carlisi 等［29］的研究发现，欧苷菊和TRAIL (肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)在HepG2，Hep3B，SK-Hep1三种细胞系内的的联合治疗具有协同作用，欧苷菊增加了死亡受体TRAIL-R1 和-R2 总量的蛋白或者mRNA 水平，而这种作用可能也和STAT 蛋白的形成活性有关。

2.2.2 抑制NF-kB 活性 核因子kB 蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基因启动子部位的kB 位点发生特异性的结合从而促进其转录表达，参与细胞生长、分化、炎症，及免疫反应、凋亡等多种基因表达调控，与炎症反应、肿瘤细胞增殖和凋亡有着密切联系。有研究发现，通过抑制HCC 细胞内NF-kB 信号通路的激活，能降低VEGF、MMP 表达而达到抑制HCC 血管生成的作用［30］。研究发现很多中药提取物具有抑制HCC 细胞NF-kB 活性的作用，Yu 等［31］将各组HepG2 细胞培养在含不同剂量(10、50、100、200μm)白藜芦醇的无血清培养基内，对照组用无血清DMEM 培养基，并通过western bloting、RT-PCR 等方法进行研究发现，相对于对照组，实验组细胞的NF-kB 活性受到明显抑制，并观察到VEGF 蛋白和mRNA 表达也均明显降低。同时进行的体外试验也发现实验组裸鼠移植瘤内增生的血管内皮细胞数量明显减少，微血管密度下降。表明白藜芦醇对HCC 血管生成具有抑制作用，并支持了NF-kB 信号通路对VEGF 表达有抑制作用这一观点。三桠乌药提取物［32］同样能够降低HCC 细胞内NF-kB 的转录活性，以及IGF-1 诱导的VEGF 表达，其机制可能是药物减弱了IGF-1R上游靶点如AKt、Atat3、ErK 的活性，而对HCC 的血管生成和细胞存活起到直接的损害作用。此外，对苦马豆素［33］和黄芪皂苷［34］的研究也发现了其对HCC 细胞NF-kB 活性的抑制作用。

2.2.3 调控其他血管生成调控因子上游因子 除NF-kB 和STAT3 外，还有一些相关中药提取物的研究指标涉及到HCC细胞VEGF 表达和血管生成，如:牛樟芝［35］的生物制品ACMFB 具有显著抑制HCC 肿瘤生长和肿瘤细胞生存能力的作用，并能抑制内皮细胞迁移和血管生成活性。同时观察到AC-MFB可以下调HCC 细胞内的缺氧诱导因子-1α 水平，而抑制HCC细胞内的VEGF 产生。芹黄素［36］的抗血管生成活性研究除了观察到芹黄素能下调huh-7 细胞内的VEGF 和MMP-8 表达，还发现细胞迁移的抑制和波形蛋白、I 型胶原的下调相一致，提示了波形蛋白可能是肝癌肿瘤血管生成的关键因素并且是抗血管生成活性的靶点。

3 结语

抗血管生成研究作为肝癌治疗的新研究方向，给众多的中晚期肝癌患者带来了曙光。索拉菲尼等抗血管生成药物的上市，在延长肝癌患者生存时间，提高生活质量方面具有着重大意义，但这些药物仍不可避免的存在耐药的问题，疗效并不持久。传统中医中药在肝癌治疗和预防方面已经显示了显著的疗效。运用现代分子生物学技术对传统中药及中药提取物进行分析，不仅能使传统中药的抗肝癌疗效机制得以阐明，使中药的抗肝癌机制更加系统和科学，而更容易被世人认同;同时作为抗肝癌血管生成药物开发的一个方向，具有无耐药、低成本、低毒的优势，以及较强的临床应用潜在价值和广阔的开发前景。同时近年相关研究还存在着以下问题:①肝癌的血管生成是一个复杂的过程，而大多数研究指标都集中在主要的几个血管生成调控因子上，对其他种类众多的血管生成调控因子研究并不多。②尽管目前已经有华蟾素、紫杉醇等抗癌中药用于肝癌的治疗并且取得较好疗效，显示了开发中药抗癌新药的巨大潜力。但在中药抑制肝癌血管生成方面，多数研究仍处于实验阶段，仅限于细胞和动物试验，还缺乏后续研究，尚没有令人信服的成果出现。

［1］Huynh H.Molecularly targeted therapy in hepatocellular carcinoma［J］.Biochem Pharmacol，2010，80 (5):550 -560.

［2］杜琴，胡兵，沈克平，等.肝癌中医病机与治法研究［J］.世界中西医结合杂志，2010，5 (9):814 -817.

［3］Yang ZF，Poon RT.Vascular changes in hepatocellular carcinoma［J］.Anat Rec (Hoboken)，2008，291 (6):721 -734.

［4］Ferrara N.Vascular endorthelial growth factor as a target for anticancer therapy［J］.Oncologist，2004，9 (suppl 1):2 -10.

［5］Semela D，Dufour JF.Angiogenesis and hepatocellular carcinoma［J］.Journal of Hepatoloy，2004，41 (5):864 -880.

［6］Hanahan D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis ［J］.Cell，1996，86 (3):353 -364.

［7］Kerbel RS.Tumor angiogenesis ［J］.The New England Journal of Medicine，2008，358 (19):2039 -2049.

［8］Welker MW，Trojan J.Anti-angiogeneses in hepatocellular carcinoma treatment:currunt evidence and future perspectives ［J］.World J Gastroenteril，2011，17 (26):3075 -3081.

［9］Hui Jun Zhou，Jia Li Zhang Ao Li，et al.Dihydroartemisinin improves the efficiency of chemotherapeutics in lung carcinomas in vivo and inhibits murine Lewis lung carcinoma cell line growth in vitro［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，66 (1):21 -29.

［10］Poon RT，Ho Jw，Tong CS，et al.Prognostic significance of serum vascular endothelial growth factor and endostatin in patients with hepatocellular carcinoma ［J］.Br J Surg，2004，91 (10):1354 -1360.

［11］Guo Yin Zheng，Hai Liang Xin，Yan Fen XU，et al.Total Saponin from root of actinidia valvata dunn in hibits hepatoma 22 growth and metastasis in vivo by suppression angiogenesis ［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012:432814.

［12］盛庆寿，张华，农慧，等.青蒿琥酯对H22 小鼠肿瘤VEGF 表达的影响［J］.中国药理与临床，2008，24 (2):8 -10.

［13］Shirakami Y，Shimizu M，Adachi S，et al.(-) -Epigallocatechin gallate suppresses the growth of human hepatocellular carcinoma cells by inhibiting activation of the vascular endothelial growth factor-vascular endothelial growth factor receptor axis ［J］.Cancer Sci，2009，100 (10):1957 -1962.

［14］Liu H，Liang Y，Wang L，et al.In vivo and in vitro suppression of hepatocellular carcinoma by EF24，a curcumin analog ［J］.PLoS one，2012，7 (10):e48075.

［15］Jie S，Li H，Tian Y.et al.Berberine inhibits angiogenic potential of Hep G2 cell line through VEGF down-regulation in vitro ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26 (1):179 -185.

［16］M.Karlkura，T.Miyase，H.Tanizawa，et al.Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponins.VII.Comparison of the decomposition modes of ginsenoside-Rb1 and-Rb2 in the digestive tract of rats ［J］.Chem Pharm Bull，1991，39 (9):2357 -2361.

［17］Ming Y，Chen，Z，Chen L，et al.Ginsenoside compound K attenuates metastatic growth of hepatocellular carcinoma，which is associated with the translocation of nuclear factor-KB p65 and reduction of matrix metalloproteinase-2/9 ［J］.Planta Med，2011，77 (5):428 -433.

［18］Weifeng T，Feng S，Xiangji L，et al.Artemisinin inhibits in vitro and in vivo invasion and metastasis of human hepatocellular carcinoma cells［J］.Phytomedicine，2011，18 (2 -3):158 -162.

［19］Yu Hb，Zhang Hf，Li Dy，et al.Matrine inhibits matrix metalloproteinase-9 expression and invasion of human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Asian Nat Prod Res，2011，13 (3):242 -250.

［20］Cao Z，Liao L，Chen X，et al.Enhancement of antitumor activity of low-dose 5-fluorouracil by combination with Fuzheng-Yiliu granules in hepatoma 22 tumor-bearing mice ［J］.Integr Cancer Ther，2013，12(2):174 -181.

［21］Wang Wz，Li L，Liu My，et al.Curcumin induces FasL-related apoptosis through p38 activation in human hepatocellular carcinoma Huh7 cells ［J］.Life Sci，2013，92 (6 -7):352 -358.

［22］Ma Y，Wang J，Liu L，et al.Genistein potentiates the effect of arsenic trioxide against human hepatocellular carcinoma:role of Akt and nuclear factor-κB ［J］.Cancer Lett，2011，301 (1):75 -84.

［23］Subramaniam A，Shanmugam MK，Perumal E，et al.Potential role of signal transducer and activator of transcription (STAT)3 signaling pathway in inflammation，survival，proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma ［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1835 (1):46 -60.

［24］Wang Xh，Liu Br，Qu B，et al.Silencing STAT3 may inhibit cell growth through regulating signaling pathway，telomerase，cell cycle，apoptosis and angiogenesis in hepatocellular carcinoma:potential uses for gene therapy ［J］.Neoplasma，2011，58 (2):158 -171.

［25］Rajendran P，Li F，Shanmugam MK，et al.Honokiol inhibits signal transducer and activator of transcription-3 signaling，proliferation，and survival of hepatocellular carcinoma cells via the protein tyrosine phosphatase SHP-1 ［J］.J Cell Physiol，2012，227 (5):2184 -2195.

［26］Yang J，Cai X，Lu W，et al.Evodiamine inhibits STAT3 signaling by inducing phosphatase shatterproof 1 in hepatocellular carcinoma cells［J］.Cancer Lett，2013，328 (2):243 -251.

［27］Tan Sm，Li F，Rajendran P，et al.Identification of beta-escin as a novel inhibitor of signal transducer and activator of transcription 3/Janus-activated kinase 2 signaling pathway that suppresses proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells ［J］.J Pharmacol Exp Ther，2010，334 (1):285 -293.

［28］Rajendran P，Li F，Shanmugam MK，et al.Celastrol suppresses growth and induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma through the modulation of STAT3/JAK2 signaling cascade in vitro and in vivo ［J］.Cancer Prev Res (Phila)，2012，5 (4):631 -643.

［29］Carlisi D，D'Anneo A，Angileri L，et al.Parthenolide sensitizes hepatocellular carcinoma cells to TRAIL by inducing the expression of death receptors through inhibition of STAT3 activation ［J］.J Cell Physiol，2011，226 (6):1632 -1641.

［30］Wu Jm，Sheng H，Saxena R，et al.NF-kappaB inhibition in human hepatocellular carcinoma and its potential as adjunct to sorafenib based therapy ［J］.Cancer Lett，2009，278 (2):145 -155.

［31］Yu Hb，Zhang Hf，Zhang X，et al.Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular carcinoma cells through a NF-kappa Bmediated mechanism ［J］.Hepatogastroenterology，2010，57(102-103):1241 -1246.

［32］Freise C，Ruehl M，Erben U，et al.A hepatoprotective Lindera obtusiloba extract suppresses growth and attenuates insulin like growth factor-1 receptor signaling and NF-kappaB activity in human liver cancer cell lines ［J］.BMC Complement Altern Med，2011，11 (1):3 -9.

［33］You N，Liu W，Wang T，et al.Swainsonine inhibits growth and potentiates the cytotoxic effect of paclitaxel in hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo ［J］.Oncol Rep，2012，28 (6):2091 -2100.

［34］Auyeung KK，Law PC，KO JK，Astragalus saponins induce apoptosis via an ERK-independent NF-kappaB signaling pathway in the human hepatocellular HepG2 cell line ［J］.Int J Mol Med，2009，23 (2):189 -196.

［35］Liu Ym，Liu Yk，Lan Kl，et al.Medicinal Fungus Antrodia cinnamomea Inhibits Growth and Cancer Stem Cell Characteristics of Hepatocellular Carcinoma ［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:569 -737.

［36］Kim Br，Jeno Yk，Nam Mj.A mechanism of apigenin-induced apoptosis is potentially related to anti-angiogenesis and anti-migration in human hepatocellular carcinoma cells ［J］.Food Chem Toxicol，2011，49 (7):1626 -1632.