霍山石斛多糖的肠黏膜免疫调节活性及在小肠中的吸收分布

郝 冉，王正明，查学强，潘利华，罗建平

霍山石斛多糖的肠黏膜免疫调节活性及在小肠中的吸收分布

郝 冉，王正明，查学强，潘利华，罗建平*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，中草药与功能食品研究所，安徽 合肥 230009）

目的：研究霍山石斛多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）的小鼠肠黏膜免疫调节活性以及在小肠内的吸收分布。方法：通过溴化氰活化法对DHP进行荧光标记，检测荧光标记前后的肠黏膜免疫调节活性；通过口服和离体小肠培养以及Peyer’s结细胞培养，用激光共聚焦显微镜检测DHP在小肠内的吸收分布以及与Peyer’s结细胞的结合。结果：DHP在质量浓度为25、50、100 μg/mL和200 μg/mL时，其肠黏膜免疫调节活性分别提高到对照组的112.8%、131.1%、137.6%和160.5%，荧光标记不改变DHP肠黏膜免疫活性；DHP在体内和体外均可被小肠吸收，分 布于肠黏膜固有层内，并可与Peyer’s结内细胞结合。结论：DHP具有肠黏膜免疫调节活性，可以通过Peyer’s结细胞被小肠吸收，并分布于固有层内。

霍山石斛；多糖；荧光标记；肠黏膜；分 布

肠黏膜免疫系统是体内最大和最复杂的免疫系统，由组织化的淋巴组织和分散的淋巴细胞组 成，其中Peyer’s结是一种重要的肠黏膜组织化淋巴组织，是肠黏膜免疫反应的诱导位点[1]。研究表明，中药及其多糖口服后能够通过小肠吸收[2-3]，调节肠黏膜免疫，进而通过细胞因子及淋巴细胞归巢影响系统免疫[4-6]。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng）是一种名贵药食同源植物，具有保肝、明目、益 胃的功能[7]，多糖是其主要活性成分[8]。 药理学研究表明，霍山石斛多糖具有抗氧化[9-10]、抗白内障[11-12]、抗糖基化[13]、抗肝损伤和肝纤维化[14]、抗疲劳[15]和免疫调节[16-18]等活性，但关于霍山石斛多糖的肠黏膜免疫调节活性和口服后在小肠内的吸收分布还不清楚。本实验采用溴化氰活化法对霍山石斛均一多糖（Dendrobium huoshanense polysaccharide，DHP）进行荧光标记，检测其肠黏膜免疫调节活性，并在体内和体外分析DHP在小肠内的吸收分布及与小肠细胞的结合，以期阐明霍山石斛多糖的肠黏膜免疫调节活性及在小肠中的吸收分布，为霍山石斛多糖功能性食品开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霍山石斛均一多糖DHP按本实验室Zha Xueqiang等[17]的方法制备，分子质量为6 400 u。SPF级雄性昆明小鼠（6～8 周，（20±2）g）购自安徽医科大学实验动物中心。

Sephadex G25 美国Sigma公司；改良型RPMI-1640培养基 美国Thermo Fisher公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；Alamar Blue试剂盒 上海贝博试剂公司；荧光素胺 美国Aldrich公司；冰冻切片包埋剂O.C.T 美国Sakura公司。

1.2 仪器与设备

CT15RT高速冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；MCO-17AIC CO2培养箱 日本Sanyo公司；Varioskan Flash酶标仪 美国Thermo Fisher公司；CM1900冷冻切片机 德国Leica公司；TCS SP5激光共聚焦显微镜 德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 荧光标记DHP的制备

用溴化氰活化法对DHP进行荧光标记[19]。将1 mL DHP溶液（20 mg/mL）与0.2 mL溴化氰（cyanogens bromide，CNBr）溶液（50 mg/mL）混合，边振荡边加入0.25 mol/L NaOH维持pH 11以上15 min。反应混合液利用Sephadex G25（1.0 cm ×15 cm）以pH 8.0的0.2 mol/L硼酸钠缓冲液洗脱，流速1.5 mL/min。收集含多糖的组分，立即加入2 mg荧光素胺室温下避光反应18 h。反应所得亮黄色溶液利用Sephadex G25（1.0 cm×15 cm）将荧光标记的多糖与游离的荧光素胺分离，洗脱液为不含钙镁离子的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS），pH 8.0，流速1.5 mL/min。用分部收集器收集，每管2 mL，测定每管中糖含量和荧光素胺含量。回收同时含多糖和荧光素胺的组分，即为荧光标记的多糖fl-DHP。多糖含量用苯酚-硫酸法测定[20]，荧光素胺含量按文献[19]方法测定。

1.3.2 肠黏膜免疫调节活性

多糖的肠黏膜免疫调节活性测定按照Hong等[4]的方法。小鼠处死后，70%酒精浸泡消毒。无菌取小肠，用Hank’s平衡盐溶液清洗干净，小心从小肠壁上分离Peyer’s结，置于冷的含有体积分数5%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基中。用注射器活塞通过4 层纱布磨碎Peyer’s结，离心取细胞，用含有5%胎牛血清的Hank’s平衡盐溶液洗涤 2次，每次1 500 r/min离心10 min。将细胞重悬于1 mL完全培养基中，用台盼蓝染色计活细胞数，调整细胞浓度为2×106个/mL。将Peyer’s结细胞悬液加入96 孔培养板中，每孔180 μL，每孔加入不同质量浓度的DHP或fl-DHP 20 μL（终质量浓度分别为0、25、50、100、200 μg/mL），每组5 个平行。置5% CO2、37 ℃增湿环境下培养5 d。培养结束后，离心取Peyer’s结细胞条件培养基。骨髓细胞悬液按照文献[4]制备。将骨髓细胞悬液加入96 孔板中，每孔100 μL，另加50 μL的完全培养基以及50 μL Peyer’s结细胞条件培养基，置5% CO2、37℃孵箱中培养6 d。培养结束前5 h，每孔加入20 μL的Alamar Blue试剂，继续培养至结束，利用Varioskan Flash酶标仪在激发波长为544 nm、发射波长为590 nm波长处测定荧光强度。多糖的肠黏膜免疫调节活性用相对于空白对照组（仅加PBS）的骨髓细胞增殖表示。

为了检测DHP与fl-DHP对骨髓细胞增殖是否具有直接促进作用，用终质量浓度为0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP直接培养小鼠骨髓细胞，用Alamar Blue试剂检测细胞增殖情况。

1.3.3 DHP在体内的小肠吸收

取雄性昆明小鼠9 只，随机分为3 组。在灌胃处理前，小鼠禁食12 h，自由饮水。空白对照组每只小鼠灌胃0.5 mL PBS，荧光素胺对照组每只小鼠灌胃0.5 mL 5 μg/mL荧光素胺溶液，fl-DHP处理组每只小鼠灌胃0.5 mL 100 μg/mL fl-DHP溶液。分别在灌胃0、0.5 h和3 h后处死小鼠，取出回肠段，用PBS小心的冲洗干净后，液氮冷冻。将小肠修剪成合适大小后，加适量的O.C.T制作冰冻切片，利用激光共聚焦显微镜在激发波长和发射波长分别为488 nm和530 nm处观察拍照。

1.3.4 DHP在体外的小肠吸收

取雄性昆明小鼠9 只，随机分为3 组，禁食12 h，自由饮水。小鼠处死后，取出回肠段，小心用PBS冲洗干净。仔细的将肠腔翻转，使黏膜层暴露在外部，将肠段一端用丝线扎紧，向肠腔内注入适量的PBS后扎紧另一端。将处理好的回肠段分别置于含PBS或5 μg/mL荧光素胺或100 μg/mL fl-DHP的RPMI-1640培养基中，37 ℃培养0、0.5 h和3 h。培养结束后取出肠段，用PBS清洗干净后液氮冷冻。制作冰冻切片，用激光共聚焦显微镜在激发波长和发射波长分别为488 nm和530 nm处观察拍照。

1.3.5 DHP体外与Peyer’s结细胞的结合

按照1.3.2节的方法制备Peyer’s结细胞悬液，调整细胞浓度为2×106个/mL。将1 mL P eyer’s结细胞悬液加入24 孔板中，加PBS或5 μg/mL荧光素胺或100 μg/mL fl-DHP后37 ℃培养1 h。离心取细胞，用PBS洗涤两遍之后，用200 μL PBS重悬。将细胞悬液滴在载玻片上，晾干后置于4%甲醛溶液中固定1 h以上，用激光共聚焦显微镜在激发波长和发射波长分别为488 nm和530 nm处观察拍照。

为检测DHP对fl-DHP与Peyer’s结细胞结合的抑制作用，先用含有100 μg/mL DHP的培养基37 ℃条件下培养Peyer’s结细胞1 h，离心取细胞，用PBS洗涤两遍之后，再用含有100 μg/mL fl-DHP的培养基培养1 h，制作细胞涂片，用激光共聚焦显微镜在激发波长和发射波长分别为488 nm和530 nm处观察拍照。

2 结果与分析

2.1 fl-DHP的制备与分离

经溴化氰活化后的DHP与荧光素胺反应，所得混合溶液用Sephadex G25分离，测定洗脱组分中总糖和荧光素胺含量并绘制洗脱曲线。如图1所示，同时含有多糖和荧光素胺的组分即为fl-DHP。

图1 CNBr-活化的DHP与荧光素胺反应产物洗脱曲线Fig.1 Elution profile of the reaction products of CNBr-activated DHP with fluoresceinamine

2.2 DHP与fl-DHP的肠黏膜免疫调节活性分析

图2 DHP与fl-DHP肠黏膜免疫调节活性Fig.2 Intestinal mucosal immunomodulating activities of DHP and fl-DHP

尽管不同终质量浓度0、25、50、100、200 μg/mL的DHP或fl-DHP对骨髓细胞的增殖没有直接的促进作用，但DHP和fl-DHP均能通过Peyer’s结细胞显著促进骨髓细胞的增殖，并且具有剂量依赖效应（图2）。当DHP在质量浓度为25、50、100、200 μg/mL时，骨髓细胞增殖分别提高到112.8%、131.1%、137.6%和160.5%。fl-DHP与DHP的肠黏膜免疫调节活性没有显著差异，表明荧光标记不影响DHP的肠黏膜免疫调节活性。

2.3 DHP在体内的小肠吸收

图3 DHP在体内的小肠吸收（×630）Fig.3 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

如图3所示，PBS对照组中各时间段均未在小肠内检测到荧光，用荧光素胺灌胃0.5 h和3 h后能够在肠道内检测到荧光，表明荧光素胺可以通过小肠吸收。用fl-DHP对小鼠灌胃处理0.5 h后，即可在肠道固有层观察到荧光，在灌胃3 h后，能检测到较强的荧光。由于fl-DHP中不含游离的荧光素胺，且溴化氰活化法标记的多糖已被证明在生理条件下可以保持稳定[21]，因此结果表明DHP可以经小肠吸收，并分布于肠道固有层。

2.4 DHP在体外的小肠吸收

图4 DHP在体外的小肠吸收（×630）Fig.4 in vivo Small intestinal absorption of DHP (×630)

由图4可知，PBS体外培养的小鼠小肠不同时间段均未检测到荧光，用荧光素胺体外培养小鼠小肠，在0.5 h和3 h后能够检测到荧光存在，表明荧光素胺可以通过离体小肠吸收。在对离体小肠用fl-DHP处理0.5 h后，即可在肠道固有层检测到荧光，处理3 h后，能检测到较强的荧光，结果与体内实验一致。

2.5 DHP体外与Peyer’s结细胞的结合

图5 DHP在体外与Peyyeerr’s结细胞的结合（×630）Fig.5 Binding of DHP to Peyer’s patch cells in vitro (×630)

图6 荧光标记细胞占观察的Peyyeerr’s 结细胞的比例Fig.6 Ratio of fluorescent labeled cells in Peyer’s patch cells

图5、6显示DHP与Peyer’s结细胞的结合情况。用PBS处 理的Peyer’s结细胞未检测到荧光，而荧光素胺处理Peyer’s结细胞可以检测到少量的荧光，表明荧光素胺可以与Peyer’s结内某些细胞结合。用fl-DHP处理Peyer’s结细胞，发现大量Peyer’s结细胞可以与fl-DHP结合。利用DHP预先处理Peyer’s结细胞后再与fl-DHP结合，结果显示结合细胞的数量有所下降，表明DHP可以竞争性抑制fl-DHP与Peyer’s结细胞的结合，进一步证明DHP可以与Peyer’s结某些细胞结合。

3 结 论

本实验对霍山石斛均一多糖DHP肠黏膜免疫调节活性以及在小肠中的吸收分布进行了初步的研究。结果表明DHP可以通过Peyer’s结刺激骨髓细胞的增殖；溴化氰活化法对DHP进行荧光标记不改变DHP的肠黏膜免疫调节活性。体内和体外实验表明，DHP可以与Peyer’s结内的某些细胞结合，通过小肠吸收，并分布于肠道固有层。但是DHP的吸收机制以及DHP与Peyer’s结细胞结合的种类与方式还需要进一步研究。

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Intestinal Mucosal Immunomodulating Activity of Polysaccharide from Dendrobium huoshanense and Its Absorption and Distribution in Small Intestine

HAO Ran, WANG Zheng-ming, ZHA Xue-qiang, PAN Li-hua, LUO Jian-ping*
(Institute of Traditional Chinese Medicine and Functional Foods, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefe i 230009, China)

Objective: To investigate the intestinal mucosal immunomodulating activity of a homogeneous Dendrobiu m huoshanense polysaccharide (DHP) and its absorption and distribution in the small intestine of mice. Methods: DHP was labeled with fuoresceinamine via cyanogen bromide activation, and the intestinal mucosal immunomodulating activity was detected. A confocal laser scanning microscope was used to detect the absorption of DHP and binding to P eyer’s patch cells via oral administration, in vitro small intestine co-culture and co-culture with Peyer’s patch cells. Results: Th e intestinal mucosal immunomodulating activity was increased by 12.8%, 31.1%, 37.6% and 60.5% when compared with the control at DHP conce ntrations of 25, 50, 100 and 200 μg/mL, respectively. Fluorescent labeli ng had no effect on t he intestinal mucosal immunomodulating activity of DHP. It could not only be absorbed through the small intestine in vivo and in vi tro, but also could distribute in intestinal lamina propria and bind to certain cells in Peyer’s patches. Conclusion: DHP possesses intestinal mucosal immunomodulating activity and can be absorb ed through Peyer’s patch cells of the small intestine.

Dendrobium huoshanense; pol ysaccharides; fluorescent labeling; intestinal mucosa; distribution

Q94

A

1002-6630（2014）09-0256-04

10.7506/spkx1002-6630-201409050

2013-06-19

安徽省科技攻关计划项目（12010402088）；国家自然科学基金青年科学基金项目（21006019）；国家自然科学基金面上项目（31271814）

郝冉（1988—），女，硕士，研究方向为中草药与功能食品。E-mail：haoran43253@163.com

*通信作者：罗建平（1966—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与分子营养。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn