浓缩苹果汁生产过程中cAMP分布规律研究

冉仁森，郭玉蓉，刘永峰，仇农学，牛鹏飞

浓缩苹果汁生产过程中cAMP分布规律研究

冉仁森，郭玉蓉，刘永峰*，仇农学，牛鹏飞

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710 062）

探究浓缩苹果汁生产过程中3’,5’-环磷酸腺苷（3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量的分布规律。利用HPLC方法测定水浸提和乙醇浸提两种不同方式处理榨汁后的苹果果渣的cAMP含量和浓缩果汁中cAMP的含量，分析不同稀释倍数、不同可溶性固形物含量的浓缩苹果汁cAMP变化规律，并利用cAMP分配系数（DCcAMP）描述榨汁过程中cAMP含量的分布规律。结果表明：榨汁后苹果果渣中cAMP含量为（63.444 1±2.323 6）øg/g，70°Brix的浓缩苹果汁成品中cAMP含量为（58.611 3±1.349 3）øg/mL，30°Brix的浓缩苹果汁半成品中cAMP含量为（12.018 3±0.583 9）øg/mL；建立了浓缩苹果汁中cAMP含量与可溶性固形物含量之间的关系方程为y= 0.808 5x-1.218 5；测定得到70°Brix和30°Brix浓缩苹果汁的DCcAMP分别为92%和19%。因此，在浓缩苹果汁生产过程中，cAMP更趋向于存在苹果果渣中，且浓缩工艺对cAMP有富集作用。

浓缩苹果汁；苹果果渣；cAMP；高效液相色谱

3’,5’-环磷酸腺苷（3’,5’-cyclic adenosine monophosphate，cAMP）溶于水，具有环状结构，对酸、碱、热都相当稳定，不仅参与机体多种酶的代谢过程，对细胞的分裂、分化和发育起着重要的调节作用，而且还可调节基因的表达，促进mRNA的转录[1]。研究证实，cAMP作为肽类、儿茶酚胺和前列腺素等激素的“第二信使”发挥其生物效应[2]，具有中枢抑制作用、松弛平滑肌、扩张血管、抑制血小板聚集、抗炎、调节学习记忆等许多生物学功能[3-7]。自从cAMP被发现以来，国内外学者研究发现绝大多数生物体内都含有cAMP[8-9]。对于红枣中cAMP的研究，现已取得了一定的进展[10-11]。张明娟等[12]用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定了8 种枣果中cAMP的含量，cAMP含量最高为375.61 øg/g，最低为46.01 øg/g；张岩等[13]用HPLC测定浓缩枣汁中cAMP含量为4.56 mg/L；刘孟军等[14]成功在枣果中提取了cAMP，这一项技术填补了国内外天然cAMP提取的空白。然而，对于苹果中cAMP的研究，几乎是空白。1991年刘孟军等[15]研究报道鲜苹果中cAMP含量为（336.00±95.15）pmol/g，之后鲜有报道。另外，中国浓缩苹果汁约占世界浓缩苹果汁市场份额的50%以上，对于苹果汁副产物进行综合开发利用意义重大[16]。因此，本实验对浓缩苹果汁生产过程中浓缩苹果汁半成品、成品、苹果果渣中cAMP的含量进行了测定，对浓缩苹果汁生产过程中cAMP的分布规律进行了探究，以期为苹果榨汁工艺的改进和苹果副产物资源的深度开发提供理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红富士苹果 陕西咸阳市礼泉县。

cAMP标准品（纯度≥99%，色谱纯） 德国Sigma公司；甲醇（纯度为99.8%，色谱纯） 加拿大Promptar公司；乙醇、磷酸二氢钾均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪 美国Waters公司；色谱柱HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Agilent公司；TU-2000型紫外-可见分光光度计 日本日立公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；陕西师范大学浓缩苹果汁生产线 无锡科安食品机械有限公司、上海神农机械有限公司、南京开米科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 浓缩苹果汁生产工艺

原料的前处理：挑选除去病虫害、霉变的苹果。

清洗：用鼓泡清洗机洗净果皮上的泥沙和杂质，并用清水淋洗。

破碎打浆：利用打浆机打浆，破碎粒度控制在4～9 mm。

酶解液化：苹果浆进入酶解罐后，加入果浆酶至质量浓度为200 mg/L，搅拌均匀，50～55 ℃保温酶解40 min。

榨汁：苹果浆酶解之后，利用带式榨机进行榨汁，苹果汁经卧螺离心机分离。

前巴氏杀菌：苹果汁温度快速升高为85～95 ℃，保温30 s，进行第一次巴氏杀菌，杀菌后将温度快速降温至50～53 ℃。

酶解、澄清：向50～53 ℃的苹果汁中依次加入果胶酶和淀粉酶，使其质量浓度分别达到220 mg/L和60 mg/L；保温酶解60 min后，用碘试剂做淀粉检测、酸化酒精做果胶检测，均显阴性时，开始超滤。

超滤：通过0.2 μm的超滤膜管进行超滤，超滤控制压力小于0.065 MPa，截留分子质量为60 kD，超滤后再用树脂柱吸附。

浓缩：通过浓缩蒸发设备将苹果汁浓缩至可溶性固形物含量为70°Brix。一效蒸发温度为80～90 ℃，二效蒸发温度为60～70 ℃，真空度为0.09 MPa。

后巴氏杀菌：对浓缩的苹果汁进行第二次巴氏杀菌45 s，温度为（85±2）℃。

无菌灌装：杀菌后的浓缩苹果汁温度快速降至30 ℃，然后用自动化灌装设备进行无菌灌装。

贮存：0～5 ℃储藏室内存放。

1.3.2 浓缩苹果汁生产过程中样品的采集

实验样品分别在榨汁后、超滤后及贮存过程中采集。榨汁工艺完成后取样，采集榨汁之后的苹果果渣，称为果渣样本。超滤后蒸发、浓缩2 h左右得到可溶性固形物为30°Brix的浓缩苹果汁，称为浓缩苹果汁半成品样本。贮存过程中取样，采集存放在储藏室内的最终灌装的可溶性固形物为70°Brix浓缩苹果汁，称为浓缩苹果汁成品样本。

1.3.3 cAMP样本溶液的制备

果渣样本cAMP样品溶液的制备：水浸提方法是按1∶20（m/V）加入蒸馏水，于40 ℃水浴环境下提取24 h，每隔8 h搅拌一次；乙醇浸提方法是按1∶20加入20%乙醇溶液，于40 ℃水浴环境下提取24 h，每隔8 h搅拌一次。两种方法浸提完成后，将浸提液于（50±5）℃、0.096 MPa的条件下真空浓缩，冷却至室温后，定容至50 mL，放入冰箱保存备用。

半成品样本cAMP样品溶液的制备：取浓缩过程中的浓缩苹果汁半成品样本，吸取5、2、1 mL样本于10 mL容量瓶中，用流动相分别定容至刻度，分别获得稀释倍数为2、5、10 倍的半成品样本cAMP样品溶液，放入冰箱保存备用。

成品样本cAMP样品溶液的制备：取浓缩后的浓缩苹果汁成品样本，吸取5、2、1 mL样本于10 mL容量瓶中，用流动相分别定容至刻度，分别获得稀释倍数为2、5、10 倍的成品样本cAMP样品溶液，放入冰箱保存备用。

1.3.4 不同样本中cAMP含量的测定

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱为HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇与含0.05 mol/L磷酸二氢钾的双蒸水（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：室温；进样量：20 øL；检测波长：259.00 nm。

1.3.4.2 苹果中cAMP的定性检测

采用保留时间法[17]，在相同的色谱条件下，以待测物质的保留时间与标准品的保留时间相比对，相同的物质应具有相同的保留时间，进行所要分析组分的定性。

1.3.4.3 绘制标准曲线

精密称取cAMP标准品0.014 3 g，用双蒸水溶解并定容至250 mL，摇匀得57.2 øg/mL的储备液，分别吸取5、15、25、35、45 mL的储备液于50 mL容量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜。分别精密吸取系列标准溶液20 øL注入色谱仪，记录色谱图。

1.3.4.4 果渣样本中cAMP含量的测定

将水浸提苹果渣所获得的样品溶液分为3 组，过0.45 μm滤膜，分别进样测定；将20%乙醇浸提苹果渣所获得的样品溶液分为3 组，过0.45 μm滤膜，分别进样测定。根据式（1），计算出果渣样品中cAMP含量（CS）。

式中：V为制备样品溶液浓缩定容后的体积/mL；ρ为HPLC测定样品溶液中cAMP的质量浓度/（øg/mL）；m为制备样品溶液所用样品的质量/g。

1.3.4.5 浓缩苹果汁半成品、成品样本中cAMP含量的测定

分别将半成品样本cAMP样品溶液、成品样本cAMP样品溶液过0.45 μm滤膜后，精密吸取20 øL注入色谱仪，分别进样测定。根据式（2）计算出果汁样品中cAMP的含量（CL）。

式中：n为稀释倍数；ρ为HPLC测定样品溶液中cAMP质量浓度/（øg/mL）。

1.3.5 苹果cAMP分配系数的计算

借鉴双水相体系中物质的分配系数的定义[18]，浓缩苹果汁和苹果果渣中cAMP分配系数（DCcAMP）为单位体积浓缩苹果汁中cAMP含量（CL）与单位质量苹果果渣中cAMP含量（CS）的百分比值，根据式（3）计算。

2 结果与分析

2.1 cAMP含量的测定

2.1.1 苹果cAMP的定性检测

图1 cAMP标准品（A）、苹果果渣（B）及浓缩苹果汁（C）高效液相色谱图Fig.1 Chromatograms of cAMP standard (A), apple pomace (B) and apple juice concentrate (C)

由图1可知，cAMP标准品保留时间为3.389 min，苹果果渣样品溶液中为3.363 min，浓缩苹果汁样品溶液中为3.362 min，样品中与cAMP标准品的保留时间一致。而且，样品中的目标峰与其他峰分离效果都较好，故证明样品中的目标峰为cAMP峰。

2.1.2 不同样本中cAMP的含量

表1 苹果果渣中cAMP的含量Table 1 cAMP contents in apple pomace

由表1可知，用蒸馏水浸提制备样品溶液，测定苹果果渣中cAMP含量为（63.444 1±2.323 6）øg/g；用乙醇溶液浸提制备样品溶液，测定苹果果渣中cAMP含量为（44.706 4±1.672 9）øg/g。由此可见，不同的浸提方式对测定结果有所影响，用蒸馏水浸提测定的cAMP含量高于用20%乙醇溶液浸提测定的cAMP含量。导致水浸提方法cAMP含量较高的原因可能有：一是由于cAMP在水溶液中的溶解度比在一定体积分数乙醇溶液中的溶解度高；二是由于cAMP的6 种不同的分子结构在蒸馏水浸提液中的优势构象与乙醇溶液中的优势构象不同，溶剂化作用不同，所以测定结果有明显差异。

表2 不同稀释倍数浓缩苹果汁中cAMP含量Table 2 cAMP contents in concentrated apple juice with different dilution facttoorrss

浓缩苹果汁成品样本经稀释10、5、2倍后，可溶性固形物含量为7、14、35°Brix；浓缩苹果汁半成品样本经稀释10、5、2倍后，可溶性固形物含量为3、6、15°Brix。由表2可知，可溶性固形物含量为70°Brix的浓缩苹果汁中cAMP含量最高为（58.611 3±1.349 3）øg/mL，可溶性固形物含量为30°Brix的浓缩苹果汁中cAMP含量最高为（12.018 3±0.583 9）øg/mL。表2同时也表明，成品、半成品浓缩苹果汁中cAMP含量的测定结果均呈现随着稀释倍数增大而增大的趋势。可溶性固形物含量为70°Brix的成品浓缩苹果汁，cAMP含量随着稀释倍数增大而增大，当稀释倍数为5～10 倍时，达到最大而趋于稳定，且不同稀释倍数cAMP含量差异不显著（P＞0.05）。可溶性固形物含量为30°Brix的半成品浓缩苹果汁， cAMP含量也随着稀释倍数增大而增大，当稀释倍数为5～10 倍时，cAMP含量达到最大而趋于稳定，且不同稀释倍数cAMP含量差异不显著（P＞0.05）。可见，在用HPLC检测浓缩苹果汁中cAMP含量时，需要至少稀释5 倍才能进行测定。

图2 不同可溶性固形物含量的浓缩苹果汁中cAMP含量变化Fig.2 cAMP contents of in concentrated apple juice with different soluble solid contents

对半成品、成品浓缩苹果汁用流动相分别稀释10、5和2 倍，使可溶性固形物含量分别达到了3、6、15、7、14、35°Brix，因2倍稀释倍数的HPLC测定结果差异较大（P＜0.05），所以去除15°Brix和35°Brix的检测结果。由图2可见，随着可溶性固形物含量的增大，稀释后浓缩苹果汁cAMP的含量随之增大。本研究拟合出了浓缩苹果汁cAMP含量与可溶性固形物含量之间的方程y=0.808 5x－1.218 5（R2= 0.922 6）。从而，可以通过此方程，简单推测出不同可溶性固形物的浓缩苹果汁cAMP的含量。

2.2 苹果cAMP分配系数的计算结果

根据苹果DCcAMP的计算公式得到，30°Brix半成品浓缩苹果汁DCcAMP为19%，70°Brix成品浓缩苹果汁DCcAMP为92%。可见，70°Brix成品浓缩苹果汁中DCcAMP明显大于30°Brix半成品浓缩苹果汁的DCcAMP。

3 讨 论

3.1 不同可溶性固形物含量、不同稀释倍数浓缩苹果汁中cAMP的含量

浓缩苹果汁的可溶性固形物含量不同，cAMP含量亦不同；浓缩苹果汁稀释倍数在一定范围内，浓缩苹果汁可溶性固形物含量越大，cAMP含量越高。浓缩苹果汁的可溶性固形物含量主要由葡萄糖、阿拉伯糖、果糖等单糖组成的多糖或是单糖构成，其中葡萄糖占绝大多数[19]。浓缩苹果汁的可溶性固形物含量与生产工艺中的浓缩工艺密切有关，不同的浓缩工艺会生产出不同可溶性固形物含量的浓缩苹果汁。另外，本研究所拟合的浓缩苹果汁cAMP含量与可溶性固形物含量之间的方程y=0.808 5x－1.218 5，可用于预测已知可溶性固形物含量的浓缩果汁或稀释果汁中cAMP的含量。因此，通过改进浓缩苹果汁的生产工艺，用纯水调整浓缩苹果汁可溶性固形物含量，从而改善苹果汁中cAMP的含量，达到改善苹果汁营养价值的目的。

浓缩苹果汁的稀释倍数对cAMP含量的测定也有一定的影响，溶液中溶剂通过范德华力、电荷转移相互作用、疏水力和氢键结合等分子间的相互作用产生溶剂效应来影响光谱吸收[20]。所以可能是由于随着稀释倍数的增大，浓缩苹果汁中的可溶性固形物含量相对减小，从而使浓缩苹果汁体系中的糖、水等分子与cAMP分子之间的相互作用会大大减弱，以至于不再影响浓缩苹果汁中cAMP含量的测定，这种现象可以称之为糖的溶质效应。因此，当浓缩苹果汁稀释5～10 倍时，cAMP含量的测定结果基本上没有明显变化。

3.2 浓缩工艺对cAMP分布规律的影响

在本研究中，浓缩苹果汁生产过程中cAMP的分布规律用DCcAMP作为指标。DCcAMP直接反映了浓缩苹果汁生产过程中cAMP的分布规律。DCcAMP越大，说明浓缩苹果汁中cAMP占的比例越高，浓缩苹果汁对cAMP的利用率越高；反之，DCcAMP越小，说明苹果果渣中cAMP的比例越高，浓缩苹果汁对cAMP的利用率越低。

由实验结果可知，70°Brix浓缩苹果汁的DCcAMP值为92%，远大于30°Brix浓缩苹果汁的DCcAMP值19%，这说明70°Brix浓缩苹果汁中cAMP含量高于30°Brix的浓缩苹果汁中的cAMP含量，浓缩苹果汁的可溶性固形物含量越高，cAMP含量也可能越高。也就是说，浓缩工艺对cAMP有富集作用，这为生产高cAMP含量浓缩苹果汁的生产工艺研究提供了理论依据。

4 结 论

以两种浸提方式制备苹果果渣样品溶液，并利用HPLC测定苹果果渣中cAMP含量：用蒸馏水浸提制备样品溶液，测定苹果果渣中cAMP含量为（63.444 1±2.323 6）øg/g；用20%乙醇溶液浸提制备样品溶液，测定苹果果渣中cAMP含量为（44.706 4±1.672 9）øg/g。

利用H P L C测定了浓缩苹果汁中c A M P的含量，70°Brix的成品浓缩苹果汁cAMP含量为（58.611 3±1.349 3）øg/mL；30°Brix的半成品浓缩苹果汁cAMP含量为（12.018 3±0.583 9）øg/mL；分析了不同稀释倍数、不同可溶性固形物含量的苹果汁中cAMP的变化规律，拟合出了浓缩苹果汁cAMP含量与可溶性固形物含量之间的方程y= 0.808 5x－1.218 5。

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Distribution of cAMP during Production of Concentrated Apple Juice

RAN Ren-sen, GUO Yu-rong, LIU Yong-feng*, QIU Nong-xue, NIU Peng-fei
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The distribution pattern of 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate(cAMP) during the production of concentrated apple juice was investigated. HPLC was employed to determine the cAMP content in apple pomace left after juice extraction with water or aqueous ethanol and in concentrated apple juice. The change trend of cAMP content in concentrated apple juice was analyzed as a function of dilution factor and soluble solid content. Distribution coefficient (DCcAMP) was calculated to describe the distribution regularity of cAMP. The result showed that cAMP contents in apple pomace, 70 °Brix concentrated apple juice, and 30 °Brix concentrated apple juice were (63.444 1 ± 2.323 6) øg/g, (58.611 3 ± 1.349 3) øg/mL and (12.018 3 ± 0.583 9) øg/mL, respectively. An equation indicating cAMP content (y) as a function of soluble solid content (x) in concentrated apple juice was established as follows: y = 0.808 5x - 1.218 5. Furthermore, the DCcAMPof 70 °Brix and 30 °Brix concentrated apple juice were 92% and 19%, respectively. Thus, during the production of concentrated apple juice, cAMP preferred to exist in apple pomace and could be enriched by the concentration process

apple juice concentrate; apple pomace; 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate; HPLC

TS275.5

A

1002-6630（2014）09-0096-05

10.7506/spkx1002-6630-201409020

2013-07-03

陕西省科技计划攻关项目（2012NY2-17）；国家现代农业（苹果）产业技术体系建设专项（CARS-28）

冉仁森（1990—），男，本科，主要从事食品科学与营养学研究。E-mail：sankeshumy@163.com

*通信作者：刘永峰（1981—），男，副教授，博士，主要从事食品生物技术及营养学研究。E-mail：yongfeng200@126.com