2种豆类植物病原细菌的红外光谱检测与鉴定

徐晓鸥,吴志毅,陈 曦,王有杰,夏 拯

（1.浙江大学,浙江杭州 310058；2.浙江出入境检验检疫局,浙江杭州 310016）

2种豆类植物病原细菌的红外光谱检测与鉴定

徐晓鸥1,2,吴志毅1,2,陈 曦2,王有杰2,夏 拯2

（1.浙江大学,浙江杭州 310058；2.浙江出入境检验检疫局,浙江杭州 310016）

菜豆细菌性晕疫病与豌豆细菌性疫病是由丁香假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）细菌引起的2种重要豆科作物细菌性病害。传统检测方法不仅周期长,且鉴定步骤繁琐。本研究首次使用红外光谱技术进行检测和鉴定,发现2种病原菌在3000～4000cm-1内具有特异性峰位,显示该方法可行。

菜豆晕疫病；豌豆细菌性疫病；红外光谱技术

菜豆晕疫病是豆科作物一种重要的检疫性细菌病害［1-2］,可侵染扁豆,赤豆,木豆,桑橙,多花菜豆,月豆,菜豆,碗豆,葛,野葛,绿豆,豇豆和大豆。尽管很多国家采取了一系列的防御措施,该病害仍以惊人的速度传播和蔓延,至今已在世界各大洲的60多个国家和地区有分布。我国黑龙江地区也有该病害发生的记录。菜豆晕疫病主要通过带菌种子作远距离传播,在田间则通过风雨、灌溉传播。发病时主要侵染叶片,初在叶片或新生叶上现不规则水浸状斑点,后在斑周围出现直径0.5～1.0cm的晕圈,斑上常有菌脓溢出；叶脉染病致叶脉坏死,易穿孔或皱缩畸形；果荚染病初现水浸状斑点,后变褐干缩下陷,斑面渗出菌脓,或病斑中央枯死点小。

豌豆细菌性疫病与菜豆晕疫病一样,同是丁香假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）细菌引起的一种重要豆科作物的细菌性病害［3-5］,其主要寄主有豌豆、扁豆、香豌豆、野豌豆。该病目前在欧洲、亚洲、美洲、大洋洲均有发生,但在我国还未见报道。豌豆细菌性疫病主要以带菌种子进行远距离传播,病菌在种子表面或种子内部至少可存活10个月,潜在传入危险性较大。所有地上部分的组织受害后表现为坏死斑,其中在茎秆和托叶上的症状最明显。系统侵染可能导致整个植株萎蔫枯死,侵染花梗可引起花和豆荚枯萎,导致植株猝倒,早期侵染可造成严重损失,对产量影响较大。

2012年,我国进口大豆5838万t,较2011年增长了10.9%。随着大豆进口量的日益增加,大豆病害进入我国的风险也随之增加。红外光谱检测技术是一种利用物体受到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收了某些频率的辐射,所产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁原理,对样品进行检测,根据产生的红外光谱图达到鉴定目的新技术［6-10］。该技术目前已在食源性致病菌检测鉴定中被应用［11-14］。本研究针对2种豆类植物病原细菌-菜豆晕疫病菌（Pseudomonassaυastanoipv.phaseolicola）以及豌豆细菌性疫病菌（Pseudomonassyringaepv.Pisi）进行了红外光谱检测鉴定研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

豌豆细菌性疫病菌菌株LMG579和菜豆晕疫病菌菌株LMG2245标准菌株,自于比利时根特大学微生物学试验室（世界菌种协会）的惠赠。

试验仪器有Nicolet5700红外光谱仪（美国热电公司）,气浴震荡仪,干燥浓缩仪,培养箱、显微镜、离心机等其他小型仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 干燥菌株制备

将菌株接种至NA培养基上,30℃培养12～24h；挑取单菌落接种至NB培养液中,30℃下180r·min-1培养12h,制成种子液,将20μL种子液均匀转接至8mL的NB培养液中,30℃下180r·min-1培养24h；将菌悬液20℃下8000r·min-1离心4min；并用NaCl洗涤3次,得到菌体细胞,将其放入真空浓缩干燥器中使之完全干燥,每株菌制备2个干燥菌株样品。

1.2.2 红外检测流程

以1∶100的比例,将制备好的干燥菌株样品溴化钾混合磨碎压片（100kg·cm-2,1200psi）8 min,用红外光谱测定。光谱分辨率为4cm-1,测量范围500～4000cm-1,扫描信号累加32次,自动平滑处理,自动基线校正,扫描时实时扣除H2O和CO2的干扰,设不放入样品的空背景作为背景,每测一样品扫描背景1次,每样品重复5次,取波普的平均值,光谱得到的数据用Grams32软件分析。

2 结果与分析

由表1,2可以看出,在500～4000cm-1内,菌株5079和2245有2个相同的峰位为3396.36cm-1（3307.66cm-1）和1463.58cm-1（1401.29cm-1）,其吸收带分别归属于O-H伸缩或N-H伸缩振动、C-H剪式和弯曲震动。另外,3548.21,3545.99,3516.18,3508.02, 3489.27,3473.10和3414.46cm-1为5079菌株所特有,前4个峰位归属于O-H（Monomeric或Hydrogenbonded）伸缩振动,后3个归属于N-H伸缩振动和O-H伸缩振动。2926.68,1651.83,1545.29, 1545.10,1241.66和1076.56cm-1的峰位为2245菌株所特有,分别归属于C-H伸缩震动和OH伸缩振动、C=C伸缩振动和NO2不对称伸缩振动、NO2不对称伸缩振动、NO2不对称伸缩振动、C-O伸缩振动和C-O伸缩振动。

表1 豌豆细菌性疫病菌菌株LMG2245的主要官能团及其强度

表2 菜豆晕疫病菌标准菌株LMG2245的主要官能团及其强度

3 小结

用红外光谱技术检测菜豆晕疫病菌和豌豆细菌性疫病,结果显示,两菌光谱有明显差异,光谱结果特异性强,在3000～4000cm-1内,分别具有特异性峰位,可作为生物标记供2种菌的鉴定使用。该方法检测周期较短,仅为2h左右,检测步骤简洁,样品前处理便捷,具有较好的应用前景。

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（责任编辑：张瑞麟）

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B

0528-9017（2014）02-0233-02

文献著录格式：徐晓鸥,吴志毅,陈曦,等.2种豆类植物病原细菌的红外光谱检测与鉴定［J］.浙江农业科学,2014（2）：233-235.

2013-10-28

浙江出入境检验检疫局科研项目（ZK200996x,ZK201310）

徐晓鸥,在职硕士,从事植物检验检疫工作。E-mail：xxo@yw.ziq.gov.cn。

吴志毅,博士,高级农艺师,从事植物检验检疫工作。E-mail：wzy@ziq.gov.cn。