动物体内麻醉剂残留检测技术研究进展

李晋成，刘 欢，吴立冬，王 群，吕海燕，宋 怿*

（中国水产科学研究院质量与标准研究中心，北京 1001 41）

动物体内麻醉剂残留检测技术研究进展

李晋成，刘 欢，吴立冬，王 群，吕海燕，宋 怿*

（中国水产科学研究院质量与标准研究中心，北京 1001 41）

动物源性食品中的麻醉剂残留和人们日常生活息息相关，已经受到越来越多的关注。目前，动物体内 的麻醉剂残留检测技术研究尚显不足，相关综述文章很少。本文综述动物体内麻醉剂残留检测技术的研究进展，重点总结样品前处理技术和分析检测技术，并且以水产品为例探讨动物体内麻醉剂残留检测的 研究方向。

动物；水产品；麻醉剂残留；样品前处理；分析检测技术

麻醉剂是一类能够抑制中枢神经系统功能的药物[1]。鱼类等食用动物使用麻醉剂后，部分机体或全部机体将暂时失去疼痛的感觉，在其手术、繁育、称质量、运输和宰杀等过程中均有重要用途[2-3]。相关研究结果表明，在鱼类长途运输过程中合理使用麻醉剂可以提高鱼类的存活率[4]。为了保证麻醉剂在减少动物疼痛过程中的使用，各国政府还制定了相应的法律法规。如德国2001年修订的《动物保护法》规定在宰杀动物过程中必须使用麻醉剂，不允许对未经麻醉的动物进行大伤手术[5]。但麻醉剂在动物，特别是食用动物中的使用而可能导致的麻醉剂残留已经引起了国内外研究人员的广泛关注。

为了满足动物体内麻醉剂残留相关研究的需要，确定动物体内麻醉剂残留浓度水平，研究人员开发出气相色谱法（gas chromatography，GC）[6]、液相色谱法（liquid chromatography，LC）[7]、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[8]和液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[9]等多种麻醉剂残留检测技术[10]。这些检测技术是为动物中麻醉剂的合理使用、动物源性食品的质量安全和政府监管提供技术支撑的前提条件。

本文根据动物中麻醉剂的使用现状，从常见动物麻醉剂的种类、样品前处理技术、分析检测技术三方面对动物体内麻醉剂残留检测研究现状进行了综述，重点总结了样品前处理技术和分析检测技术，并以水产品为重点对我国动物体内麻醉剂残留研究检测的未来发展方向进行了展望。

1 常见动物麻醉剂

动物麻醉剂的种类非常多，按照其作用方式，可以分为吸入性麻醉剂和静脉麻醉剂[11-12]；按照其性质，可以分为挥发性麻醉剂和非挥发性麻醉剂[13-14]；按照其作用区域，可以分为全身性麻醉剂[15]和局部麻醉剂[16]。为了能够同时产生多种麻醉效果，研究人员开发出复合麻醉剂，即多种麻醉剂协同使用，如美托嘧啶-氯胺酮 复合麻醉剂[17]。另外，针对动物种类的不同，允许使用麻醉剂的种类也有所差异，如牛、马、猪等兽类中使用的麻醉剂和鱼类、贝类等水产品中使用的麻醉剂存在差异。值得一提的是，目前水产品领 域仅有少量的麻醉剂被发达国家允许合法使用。美国、欧盟和加拿大允许间氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸盐（MS-222）在水产品中使用[18]，澳大利亚、韩国和新西兰允许异丁香酚在水产品中使用[19]，日本仅允许丁香酚在水产品中使用[20]，挪威允许苯唑卡因在水产品中使用[21]。我国农业部235号公告中规定安眠酮禁止在动物中使用；氯丙嗪和地西泮允许治疗用，但是不得检出；普鲁卡因、丁卡因和硫喷妥钠允许在动物中使用。一些常见的动物麻醉剂详见表1。

表1 常见的动物麻醉剂Table 1 Common animal anesthetics

2 样品前处理技术

表2 动物体内麻醉剂残留的样品前处理方法Table 2 Sample preparation techniques for the detection of anesthetic residues in animals

样品前处 理是动物体内麻醉剂残留检测的关键步骤。由于动物样品中的蛋白质和脂肪含量高，具有基质复杂、干扰物质多等特点，给麻醉剂残留的分析与检测带来了一定的困难[22]。近年来，随着社会的发展和经济的需要，为了满足日益提高的动物麻醉剂检测研究方面的要求，高效、快速的样品制备与前处理方法已经成为动物体内麻醉剂研究的热点之一。在国内外学者的不断努力下，动物源性样品前处理技术得到了飞速的发展，涌现出很多高效、快捷的样品前处理 方法，如固相萃取（solid-phase extraction，SPE）、固相微萃取（so lid-phase micro-extraction，SPME）、分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）、加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）、基质固相分散（matrix solid-phase dispersion，MSPD）等。动物体内麻醉剂残留前处理方法列表见表2。

2.1 固相萃取技术

SPE是一种把液固萃取（liquid-solid extraction，LSE）和LC结合起来的样品前处理技术[23]。SPE通过活化、上样、保留、淋洗和洗脱步骤实现对目标化合物的提取与纯化。目前常用的SPE柱有正相、反相和离子交换柱，针对麻醉剂的性质不同，如酸碱性，可以选择不同种类的SPE柱萃取和富集目标麻醉剂。在动物体内麻醉剂残留的分 析检测过程中，SPE多和色谱或色谱质谱联用技术相结合，可以减少动物样品中的基质效应。

汪丽萍等[24]利用SPE和GC-MS/MS检测技术建立了猪肉中4种麻醉剂（地西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑）残留含量的检测方 法，样品经乙腈提取和C18固相萃取净化后进行GC-MS/MS分析，地西泮的检出限为2 μg/kg，艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑的检出限均为10 μg/kg。李存等[25]利用SPE进一步扩展了麻醉剂的检测数目，猪尿样品离心后经C18固 相萃取小柱分离纯化，建立了猪尿中10种麻醉剂（噻拉嗪、阿扎哌隆、氟哌啶、氟哌啶醇、艾司唑仑、硝西泮、地西泮、奥沙西泮、氯丙嗪和奋乃静）残留含量的LC-MS/MS方法，检出限为0.11～0.52 μg/L。He Limin等[26]利用Oasis HL B 固相萃取柱净化猪肌肉、猪肝或猪肾中的麻醉剂，建立了猪体内氯丙嗪、异丙嗪、安定、阿扎哌隆、阿扎哌醇和卡拉洛尔6种麻醉剂的LC-MS/MS检测方法，检出限为0.06～0.1 μg/kg。

2.2 固相微萃取技术

SPME是一种非溶剂型选择性萃取法，是SPE的进一步发展，由Arthur等[27]在1989年最先提出。SPME材料表面固定一层和目标化合物性质相似的有机物固定相，在分子间作用力的作用下，目标化合物可以被固定相选择性吸附浓缩，然后可在气相色谱仪或液相色谱仪进样口被解吸附并进行色谱分析[28]，具有操作过程简单、重现性好等优点。目前，SPME技术可分为两种：纤维针式固相微萃取（fi ber-SPME）[29]和管内固相微萃取（in-tube SPME）[30]。SPME萃取模式有3种[31]：直接萃取（direct extraction SPME）、顶空萃取（headspace SPME）和膜保护萃取（membrane-protected SPME）。

Klimánková等[32]在纤维表面修饰一层固定相（聚二甲基硅氧烷-碳分子筛-二乙烯苯，PDMS-CAR-DV B），采用顶空固相微萃取模式，萃取鱼糜基质中的2-苯氧基乙醇，并用GC-MS/MS进行检测。经过优化，建立的方法检出限和定量下限分别为0.03 mg/kg和0.1 mg/kg。Es-Haghi等[33]等以聚乙二醇为黏结剂在纤维表面固定一层表面修饰C18固定相的SiO2纳米颗粒，建立SPME直接萃取狗血液中的地西泮的LC-MS/MS检测方法，并将该方法应用到地西泮在狗血液中代谢动力学的研究中。该方法对地西泮的检出限为1.7 ng/mL。Zhang等[34]将空间分辨SPME（space-resolved solid-phase microext raction，SR-SPME）应用到鱼肌肉中的地西泮测定中，建立了相应的LC-MS/MS测定方法，对地西泮的检出限为2.5 ng/mL。

2.3 分子印迹技术

MIT是一 种制备可以对模板分子具有选择性识别功能的聚合物固定相技术[35]。将模板分子和功能单体预组装，功能单体聚合后，模板分子被洗脱除去，在聚合物固定相中就留下可以对模板分子 选择性识别的“空穴”[36]。和传统的SPE和SPME等技术相 比，MIT由于结合了抗体-抗原和酶-底物识别体系的优点，具有选择性高、重现性好等优点。目前，MIT 多和SPE及SPME等传统样品前处理技 术相结合，可以促进传统样品前处理技术选择性的提高，更好地克服生物样品基质复杂等因素，提高样品前处理效率[37]。

刘晓芳等[38]将MIT和电化学结合起来研制出检测猪肉中地西泮残留的电导型分子印迹仿生传感器。该方法的线性范围为0.039～1.25 mg/L，检出限为0.008 mg/L；地西泮加入量为0.039～1.25 mg/L，回收率为91.3%～95.0%。Song Suqu an等[39]以氯丙嗪为 模板分子制备得到分 子印迹的聚合物材料，并将其与SPE方法结合起来应用到猪尿中氯丙嗪的HPLC检测中。该方法的检出限为0.08 mg/L。

2.4 加速溶剂萃取

ASE是一种利用在高温、高压的环境中化合物在溶剂中的溶解度会增加的原理，在高温、高压的环境中萃取固体或半固体样品中化合物的前处理方法[40]。ASE凭借有机溶剂用量少、萃取速度快、萃取效率高等优点，获得了较快发展。

Chdi等[41]将ASE应用到动物血液前处理过程中，80%甲醇-20%乙腈，80℃、150 bar、提取10 min，提取液经表面修饰C18和N-丙基乙二胺的吸附剂进行基质固相分散（matrix solid-phase dispersion， MSPD）净化，然后用LC-MS/MS检测，可以实现对阿扎哌隆等12种麻醉 剂的检测，检出限和定量下限分别为0.6～6 μg/kg和2～20 μg/kg。

2.5 基质固相分散

MSPD是在SPE基础上发展起来的一种快速样品处理技术，由美国Louisiana州立大学的Barker等[42]在1989年最先提出，具有操作简单、处理速度快等优点。其原理是将表面涂渍有C18等固定相的固相萃取材料与样品一起研磨，得到研磨好的混合物并将其装入色谱柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将待测物洗脱下来进行分析[43]。经过不断地发展，目前市场上已经有相应的试剂盒出售，如美国Waters公司开发的DisQue基质固相分散样品制备试剂盒。

渠岩等[44]采用固定相为C18的基质固相分散样品制备试剂盒净化畜禽肉（猪、牛、羊、鸡、鸭等），建立了畜禽肉中阿普唑仑、咪达唑仑、三唑仑、艾司唑仑、奥沙西泮、地西泮、硝西泮、氯硝西泮、卡马西平、利多卡因、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥13种麻醉剂的LC-MS/MS检测方法。13种麻醉剂的检出限为0.05～3 μg/kg，回收率为77.4%～100.2%。

目前，在动物样品前处理方面，除了以上提及的几种常用方法外，研究人员还开发出来了加压溶剂萃取[45]等方法。总体而言，SPE和SPME凭借较高的灵敏度和简便的操作过程，是应用最多的前处理方法。

3 检测方法

表3 动物体内麻醉剂残留检测方法Table 3 Analytical techniques for anesthetic residues in animals

目前测定动物体内麻醉剂残留的方法主要有HPLC、GC、LC-MS/MS、GC-MS/MS，相应的参考文献见表3。HPLC和GC对仪器要求相对简单，操作简便、快捷，但是灵敏度低。随着检测仪器的发展，LC-MS/MS和GC-MS/MS被用于动物体内麻醉剂残留。这些方法虽然对仪器的要求比较高，但是 灵敏度、准确度和重现性均有所提高[46-47]。

3.1 高效液相色谱法

HPLC是 最早用于检测动物体内麻醉剂残留的方法之一，由于其操作简捷，目前仍被大量用于动物体内麻醉剂残留的检测。Li Peide等[7]利用液液萃取和C18反相色谱柱分离建立狗的血液中氯胺酮、甲苯噻嗪和咪达唑仑的检测方法，氯胺酮、甲苯噻嗪和咪达唑仑的检出限分别为17.8、10.3、15.1 ng/mL。付亚平等[48]将鱼血或鱼肝经高速离心后，取上层清液经过滤后用高效液相色谱-紫外检测器分析。分别配制MS-222的含量为10、20、40 μg/mL的鱼血及鱼肝溶液，鱼血和鱼肝中MS-222的平均回收率分别为87.78%和76.66%。戴晓欣等[49]通过C18固相萃取柱净化水产品，建立了其体内苯巴比妥的HPLC检测方法，方法的检出限为10 μg/kg，定量下限30 μg/kg。

3.2 气相色谱法

GC主要是利用不同种类麻醉剂的极性、沸点和吸附性质的不同进行 分离分析。在动物体内麻醉剂残留分析方面，GC是与HPLC互补的一项检测方法，它侧重于分析具有挥发性和热稳定好的麻醉剂残留，如氟烷。Burrows等[6]以1-丙醇为内标物建立了牛血清中七氟烷的顶空气相色谱检测方法，检测器为火焰离子化检测器，七氟烷和1-丙醇的保留时间分别为2.92、1.56 min。Bergadano等[50]建立了马血液中氟烷、异氟烷和七氟烷的顶空气相色谱检测方法，并基于此方法研究了3种麻醉剂在马血 液/空气之间的分配系数。A therley等[51]以二氯甲烷为内标物和氯仿为萃取溶剂建立了兔血液中氟烷、异氟烷和七氟烷的气相色谱检测方法，氟烷、异氟烷和七氟烷的线性范围分别是50～600、50～300、50～300 μg/mL。

3.3 液相色谱串联质谱联用法（LC-MS/MS）

由于动物样品的基质复杂，色谱法直接分析麻醉剂残留的过程中存在选择性低、干扰物质较多和灵敏度有限等不足之处， LC-MS/MS以高灵敏度和高选择性 等优点在麻醉剂残留检测中 发挥了越来越多的作用。LC-MS/MS可以同时实现动物体内麻醉剂残留的定量和定性检测，多用于分析不易挥发、热稳定性差的麻醉剂及其代谢物。

Maes等[9]采用液液萃取的方法处理样品，LC-MS/MS同时检测狗或马的血浆中利多卡因及其两种代谢物（单乙基甘氨酰二甲苯胺和甘氨二甲基苯酰胺）的方法。狗血中利多卡因、单乙基甘氨酰二甲苯胺和甘氨二甲基苯酰胺的检出限分别为：0.8、2.3、55 ng/mL；在马血中的检出限分别为1.1、0.5、13 ng/mL。Scherpenisse等[52]采用pH 4.4的McIllvaine缓冲液（由563 mL 0.10 mol/L柠檬酸和437 mL 0.20 mol/L磷酸氢二钠混合制备）和甲醇混合液萃取鱼糜基质中的MS-222，C18固相萃取柱萃取纯化，然后经LC-MS/MS检测分析。MS-222在罗非鱼、鲑鱼和鲑鳟鱼中的回收率分别是：（67±10）%（加入量为2 μg/kg）、（95±7）%（加入量为2 μg/kg）和（92±3）%（加入量为2.5 μg/kg），检出限分别是0.5、0.6、0.6 μg/kg。为了减少LC-MS/MS分析过程中样品基质的干扰，Musteata等[53]利用固相微萃取提取富集老鼠血液中的地西泮及其两种代谢物去甲安定和去甲羟基安定，再利用LC- MS/MS建立了地西泮在老鼠体内的药代动力学研究方法，该方法的线性范围为3～750 ng/mL。于慧娟等[54]通过HLB固相萃取柱净化大菱鲆和鳜鱼 基质，建立了其体内地西泮及其代谢物残留的LC-MS/MS检测方法，定量下限为1.0 μg/kg 。其他的LC-MS/MS检 测动物体内麻醉剂残留方法报道见表3。

3.4 气相色谱质谱联用法（GC-MS/MS）

GC-MS/MS多用于动物体内易挥发、热稳定性好的麻醉剂及其代谢物的定量和定性检测分析，如 吸入性的麻醉剂。Deng等[8]通过顶空萃取的方法萃取富集老鼠脑组织中的异氟烷和安氟醚，建立了GC-MS/MS检测老鼠脑组织中的异氟烷和安氟醚含量的方法，异氟烷和安氟醚的回收率分别为72%和76%。朱馨乐等[63]利用C18固相萃取柱净化富集猪尿中的地西泮，建立了GC-MS/MS检测猪尿中的地西泮含量的方法。该方法的定量下限为0.5 μg/L，线性范围为10～500 μg/L。Cartisera等[64]将兔组织中的4种苯二氮卓类药物（地西泮、去甲西泮、奥沙西泮和替马西泮）经甲基叔丁基醚液液萃取和N,O-双（三甲基硅基）三氟代乙酰胺/三甲基氯硅烷在线衍生后进行GC-MS/MS，地西泮、去甲西泮、奥沙西泮和替马西泮的定量下限分别为10、1、10、10 ng/g。

目前，在动物体内麻醉剂残留的检测方法中，色谱质谱联用法以高灵敏度、抗基质干扰性、高准确性和高稳定性成为权威的检测方法。但是，满足政府监管和中、小企业自检需求的快速检测方法还有待进一步研究开发。就此而言，电化学检测技术[65]、酶联免疫分析法[66]和胶体金免疫分析法[67]的研究前景较为明朗。

4 结 语

麻醉剂作为一类在食用动物的养殖、运输和加工等领域普遍使用的药物，在动物体内残留检测方面的研究越来越受重视，但是水产品中麻醉剂残留检测研究的深度和范围仍显不足。目前，我国水产品中麻醉剂残留检测的相关研究仍然是一个薄弱地带。笔者认为，水产品领域的以下几个方面的研究值得深入展开。

4.1 水产品中麻醉剂残留检测方法标准的研究

笔者查阅资料发现，目前我国还没有水产品中麻醉剂残留检测方面的标准，这给水产品中麻醉剂残留的监控带来了很大的不便。通过对水产品中麻醉剂残留检测方法的研究，制定出科学的检测方法标准，可以为水产品养殖、运输、加工和销售过程的质量安全监管提供技术支撑。因此，水产品中麻醉剂残留检测方法标准的研究对水产品的质量安全具有非常重要的意义，将是一项急需开展的研究工作。

4.2 水产品中麻醉剂残留的快检产品开发

目前与水产品相关的快检产品多集中在禁、限用药物领域，如氯霉素、孔雀石绿等[68-69]。相对而言，水产品中麻醉剂残留的快检产品却鲜有报道。为了满足相关管理者建立水产品中麻醉剂的残留水平监测体系的监管需求，快速检测水产品中麻醉剂的残留量，已经成为一项急需完成的挑战。就此而言，水产品中麻醉剂残留的快检产品具有样品前处理简单、检测速度快、经济成本低等优点，将是解决这个难题的新途径。

4.3 水产品中麻醉剂残留风险评估的研究

风险评估是目前水产品质量安全管理的理念之一，也是制定科学监管措施的重要依据[70]。通过水产品中麻醉剂残留的风险评估，然后进行针对性的监管，可以促进监管效率的提高。然而，目前我国水产品中麻醉剂残留风险评估相关研究尚属空白领域。因此，从风险评估的角度研究水产品中麻醉剂残留的危害，可以为科学的监管措施的制定提供依据，对水产养殖业的健康发展具有非常重要的意义。

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Progress in Detection of Anesthetic Residues in Food-Producing Animals

LI Jin-cheng, LIU Huan, WU Li-dong, WANG Qun, LÜ Hai-yan, SONG Yi*
(Quality and Standard Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China)

People’s daily life is closely related to anesthetic residues in animal-derived foods, which has gained growing attention. However, there is currently insufficient research with regard to the detection of anesthetic residues in foodproducing animals and relevant review papers have been rarely published. This paper reviews the current si tuation with regard to the detection of anesthetic residues in food-producing animals with emphasis on sample pretreatment techniques and analytical techniques. Taking aquatic products as an example, we exp lore future research directions in the detection of anesthetic residues in animals.

animals; aquatic products; anesthetic residues; sample pretreatment techniques; analytical techniques

TS207.3

A

1002-6630（2014）05-0251-06

10.7506/spkx10 02-6630-201405049

2013-02-28

中国水产科学研究院院部中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2013C005）；

国家现代农业（罗非鱼）产业技术体系建设专项（2060302-425-02）

李晋成（1983—），男，助理研究员，博士，研究方向为水产品质量安全监管及检测技术。E-mail：lijc@cafs.ac.cn

*通信作者：宋怿（1963—），女，研究员，学士，研究方向为水产品质量安全与管理。E-mail：songyi@cafs.ac.cn