ZNT1在膀胱癌组织中的表达及临床意义

荆宏伟 孔垂泽 张哲 郭坤峰

ZNT1在膀胱癌组织中的表达及临床意义

荆宏伟 孔垂泽 张哲 郭坤峰

目的明确ZNT1在膀胱癌组织中表达情况，为进一步的研究奠定基础。方法免疫组化检测23例膀胱癌和9例正常膀胱组织中ZNT1的表达情况;利用Real-time RT-PCR和Western blot法检测膀胱组织中ZNT1的mRNA和蛋白表达情况，检测ZNT1在膀胱癌组织中mRNA和蛋白的表达情况，分析ZNT1基因表达的临床意义。结果免疫组化检测结果显示ZNT1在正常膀胱组织中表达非常微弱，其阳性率为22.2%，而在膀胱癌组织中其阳性率为87%，差异有统计学意义(P＜0.01)。Real Time RT-PCR及Western Blot结果均显示ZNT1在膀胱癌组织中表达显著升高，与其在正常膀胱组织中的表达量相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论ZNT1在mRNA及蛋白水平，在膀胱癌中的表达含量与其在正常膀胱组织的表达量相比均显著升高，有可能成为膀胱癌的一个早期诊断指标。

膀胱肿瘤;ZNT1;锌转运体

膀胱癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤。在美国男性中，膀胱癌是第四位最常见的癌症，是癌症致死的第九大原因，男女患者的比例大约是 3∶1.1［1］。膀胱癌发生、发展的病理过程相当复杂，涉及到很多方面，对此人们也已展开广泛的研究，关于微量元素及其相关蛋白在癌症中的作用以及与膀胱癌发生发展的关系逐渐引起了人们的重视。目前研究表明在膀胱癌患者中，血锌含量低于健康人群［2］，而尿锌的含量明显高于健康人群，说明在膀胱癌中锌的代谢存在异常，在侵袭性膀胱癌中，尿锌含量要高于浅表性膀胱癌和健康人群，同时研究也发现在膀胱癌发生的早期，组织的锌已经开始下降，因而推测锌的转运在膀胱癌的发生发展中有可能起到很重要的作用。锌转运体(Zinc Transporter，ZnT)家族是新近发现的一类金属离子转运体，其主要功能是将锌离子转出细胞内，与其功能相反的是锌铁调控蛋白(ZRT，IRT-like protein，ZIP)家族，其主要是将锌离子转入细胞，两者共同作用维持细胞内锌离子的稳定。ZNT1属于ZNT家族的一员，在锌离子的吸收转运中起到重要的作用，本试验利用免疫组化检测ZNT1在23例膀胱癌及9例膀胱正常黏膜中的表达情况，同时利用实时定量RT-PCR和Western Blot分别检测62例膀胱癌及15例正常膀胱黏膜组织中ZNT1的RNA和蛋白表达情况，揭示其与膀胱癌临床分期及病理分级之间的关系，为进一步阐明ZNT1在膀胱癌发生发展中的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 膀胱组织蜡块均来自2010年12月至2012年12月中国医科大学附属第一医院泌尿外科住院病例。其中膀胱癌患者23例，年龄32～75岁，平均年龄48.7岁。病理分类均为膀胱移行细胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行细胞癌分级标准分级:G1级11例、G2级9例、G3级3例。膀胱癌2009 TNM分期系统(UICC):Ta 15例、T1 4例、T2 1例、T3 2例、T4 1例。62例膀胱癌及15例癌旁正常膀胱新鲜组织标本均为2011年3月至2012年11月于中国医科大学附属第一医院泌尿外科住院并接受手术治疗的原发性膀胱尿路上皮癌患者的新鲜膀胱癌组织和癌旁正常组织，所有标本均得到患者授权，所有患者均为初发，复发性膀胱肿瘤和手术前曾接受放疗或化疗的患者标本剔除本研究。癌旁组织距离肿瘤边缘大于2 cm。所有患者在行膀胱部分切除或全切后留取标本于Trazol中－80℃保存，当日或次日提取总RNA和总蛋白。62膀胱癌患者年龄29～70岁，平均年龄43.4岁，入院均行经血尿生化、泌尿系直肠超声、膀胱CT或CTU检查。病理分类均为膀胱移行细胞癌(TCCB)，按照WHO(1973)膀胱移行细胞癌分级标准分级:G1级45例、G2级11例、G3级6例。膀胱癌2009 TNM分期系统(UICC):Ta 26例、T1 17例、T2 11例、T3 5例、T4 3例。肿瘤组织标本获得方式:经尿道膀胱肿瘤切除术42例，膀胱部分切除术9例，膀胱全切术11例。

1.2 主要试剂及溶液配制 兔抗人ZNT1克隆抗体购自美国Abcam公司;鼠抗人GAPDH多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;S-P免疫组化试剂盒、DAB显色剂、枸橼酸抗原修复缓冲液0.01 mol/L，pH值6.0、PBS缓冲液:0.01 mol/L，pH 值7.2 ～7.4 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;TRIzol购自美国Invitrogen公司;SYBR®PrimeScriptTM RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)试剂盒购自大连Takara公司;上下游引物均由大连宝生物工程有限公司(Takara)设计合成。

1.3 试验方法

1.3.1 免疫组化(SP法):免疫组化结果判定免疫组化结果判定方法:ZNT1定位于细胞膜，胞膜出现浅黄色至棕褐色颗粒为阳性细胞。采用阳性染色强度结合阳性细胞所占百分数进行判断。染色强度分数标准:无色为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。高倍镜下每张切片随机观察4个视野计数阳性细胞数，1% ～10%为1分;11% ～50%为2分，51% ～75%为3分;﹥75%为4分。两项得分相乘，满3分为“+”;4分为“++”;5分以上为“+++”，“+ ～ +++”为阳性表达。

1.3.2 Real-Time RT PCR:①引物:ZNT1上游引物:5’-TACCAFCAACTCCAACGG-3’;ZNT1 下游引物:5’-GAACCCAAGGCATCTCCA-3’;β-actin 上游引物:5’-TGGCACCC AGCAC A A TGAA-3’;β-actin 下游引物:5’-CTAAGTCATAGTCCGCC TAGAA GCA-3’;②组织RNA提取;③逆转录反应;④实时定量PCR反应本实验采用SYBRGreen嵌合荧光进行反应，按说明书配置25 μl反应体系。

1.3.3 Western Blot:①组织蛋白提取;②蛋白浓度测定(BCA蛋白定量检测试剂盒);③SDS-PAGE电泳;④转膜;⑤ZNT1蛋白的免疫学检测应用Chemi Image 5500凝胶成像系统成像，应用Image J分析条带灰度。

1.4 统计学分析 计数资料采用 χ2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化 免疫组化检测结果显示ZNT1定位于膀胱癌细胞胞浆内，其在膀胱癌组织中表达明显，其阳性表达率为87.0%(20/23)，而在癌旁正常膀胱组织中表达非常微弱，其阳性率为22.2%(2/9)，差异有统计学意义(χ2=9.784，P ＜0.01)。见图 1。

图1 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达

2.2 Western Blot ZNT1在膀胱癌组织中的蛋白表达含量与其在正常膀胱黏膜组织中的表达含量相比亦明显升高，与免疫组化结果及ZNT1 mRNA的变化趋势相一致，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 ZNT1蛋白在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达

2.3 Real Time RT-PCR ZNT1在62例膀胱癌组织中ZNT1的mRNA表达含量与其在15例正常膀胱黏膜组织中的表达含量相比，ZNT1的表达含量显著升高，ZNT1 mRNA在膀胱癌组织中的平均表达含量为正常膀胱黏膜组织中的6.6倍，其差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3、4。

图3 ZNT1 mRNA在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达

图4 ZNT1在膀胱癌及正常膀胱组织中的扩增曲线和溶解曲线(A＆B:ZNT1在膀胱癌及正常膀胱组织中的扩展曲线和溶解曲线;C＆D:β-actin在膀胱癌及正常膀胱组织中的扩增曲线和溶解曲线)

3 讨论

锌是机体组织和细胞内必需的微量元素，其参与体内多种蛋白质、核酸的合成和分解代谢酶的活性和构成，锌缺乏会导致机体发育迟缓，DNA合成修复受损，免疫功能缺陷等一系列疾病［3］。在膀胱癌患者中，血锌含量低于健康人群［4］，而尿锌的含量明显高浅表性膀胱癌细胞的凋亡影响更明显，推测锌与膀胱癌的发生发展可能有很大的关系，因而对锌及与其相关的蛋白都成为研究的热点［5］。

新近发现的锌转运体(Zinc Transporter，ZnT)家族是一类金属离子转运体，其主要功能是将锌离子转出细胞，与其功能相反的是锌转运体(Zinc Transporter，ZnT)家族，其主要是将锌离子转入细胞内，两者共同作用维持细胞内锌离子的稳定。目前研究显示锌转运体与许多恶性肿瘤的进展有关，其在乳腺癌和胰腺癌进展中作用已经得到部分证实［6，7］。ZnT1是ZnT家族中最先被发现的锌转运体，在组织器官分布方面，锌转运蛋白1也表现出特殊规律，其主要分布在小肠上皮细胞、肾脏上皮细胞、肝细胞及胰腺腺细胞等，有研究表明 Cd2+、Cu2+、Mg2+、Na+、K+、Cl－等，对 ZnT1 的锌外排作用几乎无影响［8］，说明ZnT1对锌的外排不受这些离子的干扰，是专一性的锌转运体。

本研究首次应用免疫组化，Real Time RT-PCR及Western Blot在蛋白及mRNA水平上检测ZNT1在膀胱癌及癌旁正常膀胱表达差异。免疫组化染色显示ZNT1在膀胱癌组织中具有很高的阳性表达率(87.0%)，而在癌旁正常膀胱组织中表达含量很低，其阳性率仅为22.2%，其组织间表达差异具有显著统计学意义，Western Blot检测亦显示ZNT1在膀胱癌组织中具有更高的表达。实时定量RT-PCR检测结果显示ZNT1 mRNA在膀胱癌中的表达含量与其在癌旁正常膀胱组织中的表达量相比升高显著，其差异具有统计学意义(P ＜0.01)，ZNT1 mRNA在膀胱癌组织中的平均表达含量为癌旁正常膀胱组织中的6.6倍。我们的研究结果显示在mRNA和蛋白水平上，ZNT1在膀胱癌组织中的表达均明显升高，表明其有可能成为膀胱癌早期诊断的一个良好指标。

总之，通过本研究我们认为ZNT1在膀胱癌组织中的表达明显升高，ZNT1可作为膀胱癌的一个早期诊断指标，其在膀胱癌的发生发展中可能扮有很重要的作用，这也为我们后续研究奠定了良好的基础，随着研究的不断深入它有可能成为膀胱癌治疗的一个重要靶点。

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2 Kagara N，Tanaka N，Noguchi S，et al.Zinc and its transporter ZIP10 are involved in invasive behavior of breast cancer cells.Cancer Sci，2007，98:692-697.

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4 Huang L，Tepaamorndech S.The SLC30 family of zinc transporters-A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.Mol Aspects Med，2013，34:548-560.

5 Mazdak H，Yazdekhasti F，Movahedian A，et al.The comparative study of serum iron，copper，and zinc levels between bladder cancer patients and a control group.Int Urol Nephrol，2010，42:89-93.

6 Li M，Zhang Y，Liu Z，et al.Aberrant expressionof zinc transporter ZIP4(SLC39A4)significantly contributes to human pancreatic cancer pathogenesis and progression.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:18636-18641.

7 Desouki MM，Geradts J，Milon B，et al.hZip2 and hZip3 zinc transporters are down regulated in human prostate adenocarcinomatous glands.Mol Cancer，2007，6:37.

8 Wang K，Zhou B，Kuo YM，et al.A novel member of a zinc transporter family is defective in acrodermatitis enteropathica.Am J Hum Genet，2002，71:66-73.

Expression and clinical significance of zinc transporter ZNT1 in bladder carcinoma

JING Hongwei，KONG Chuize，ZHANG Zhe，et al.Department of Urology，The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

ObjectiveTo detect the expression levels of zinc transporter(ZNT1)in normal bladder mucosal tissue and bladder carcinoma tissues in order to provide scientific data for further study.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression levels of ZNT1 in 23 cases of bladder cancer tissue and 9 cases of normal bladder tissue.Real Time RT-PCR and Western Blot were used to detect the mRNA and protein levels of ZNT1 in bladder carcinoma and normal bladder mucosal tissue so as to analyze the clinical significance of ZNT1 gene expression.ResultsThe immunohistochemical results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were relatively lower，with the expression positive rate being 22.2%，however，which in bladder cancer tissue was 87%，there were significant differences between normal bladder tissue and bladder cancer tissue(P ＜ 0.01).Both the Real Time RT-PCR and Western Blot analysis results showed that the expression levels of ZNT1 in normal bladder tissue were significantly increased，as compared with those in normal bladder tissues(P ＜0.01).ConclusionThe expression levels of ZNT1 mRNA and protein in bladder cancer tissue are obviously increased，as compared with those in normal bladder tissue，which may be one of indexes in the early diagnosis of bladder cancer.

bladder cancer;ZNT1;zinc transporter

R 737.14

A

1002－7386(2014)09－1285－04

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.09.001

项目来源:高等学校博士学科点专项(博导类)(编号:20112104110006)

110001 沈阳市，中国医科大学第一附属医院泌尿外科

孔垂泽，110001 中国医科大学第一附属医院泌尿外科;

E-mail:jhw_david@sina.com

2013－10－13)