山药储藏蛋白Dioscorin研究进展

高 琦，王晓文，贾有峰，张俊伟，于唐滢，薛友林,*

（1.辽宁大学轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁行政学院，辽宁 沈阳 110161）

山药储藏蛋白Dioscorin研究进展

高 琦1,2，王晓文1，贾有峰1，张俊伟1，于唐滢1，薛友林1,*

（1.辽宁大学轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁行政学院，辽宁 沈阳 110161）

作为传统的药食同源物品，山药含有丰富的营养及保健成分，包括淀粉、多糖、酚类、蛋白等。其中山药储藏蛋白Dioscorin占山药总可溶性蛋白的80%。本文综述了Dioscorin的提取工艺、基本特征及其所具有的多种生物活性，为山药蛋白的进一步开发和利用提供参考。

山药储藏蛋白；Dioscorin；提取工艺；生物活性

山药为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属多年生草质藤本植物，主要种植于非洲、亚洲、南美洲，以及加勒比海和南太平洋群岛地区。现已记录的山药有600多种，其主要的栽培品种为：D. alata、 D. bulbifera、D. cayenensis、D. esculenta、D. japonica、D. nummularia、D. opposita、D. pentaphylla、D. rotundata和D. trifid.[1]。在亚洲，D. alata、D. japonica和D. opposita作为主要的栽培品种，被广泛应用于健康食品和传统草药[2-3]。我国山药资源丰富，东北、华北、西南、华东和华中地区的17个省市都有种植，其中比较知名的有主产于河南的怀山药（D. opposita Thunb.），江浙至云贵一带的参薯（D. alata L.）以及在长江以南广泛种植的日本薯蓣（D. japonica Thunb.）[4]。《本草纲目》记载，山药“主治伤中，补虚羸，除寒热邪气，补中益气力，长肌肉，久服耳目聪明，轻身不饥延年”[5]。山药含有丰富的蛋白质，其含量为山药干质量的3%左右，其储藏蛋白Dioscorin占山药块根总蛋白质含量的80%以上[6]。

1 Dioscorin的提取及纯化

Harvey与Boulter最初使用碱溶法，将冻干的D. rotundata cv Nwapoko粉末加入pH 8.3的硼酸或Tris缓冲液中（1∶20，m/V），4 ℃搅拌4 h后，30 000×g离心取上清液，上清液经阴离子交换层析（DE-52）纯化后得到了Dioscorin（占总可溶蛋白的85%）[5]。其后的Dioscorin提取虽然都以鲜山药作为原料，但基本都以碱溶法为主，只是纯化方法稍有不同：Conlan等[7]使用Sephadex G-75凝胶层析法纯化了从D. cayenensis-rotundata中得到的Dioscorin；而在一些文献中，在离子交换层析/色谱（DE-52、DEAE Sephadex A-25、Resource Q）之前，会进行硫铵沉淀处理（保留45%～75%之间组分），以除去杂蛋白及黏多糖等杂质[8-10]。

2 Dioscorin的基本特征

Dioscorin作为细胞质蛋白凝聚体存在于山药块根的液泡中[7,11]，虽然来源于不同品种，但其分子质量均大致为31kD[6,11,13]。此蛋白质为多种异形体（isoform）的混合物，早期的研究根据其基因序列将其分为A与B两大类，两者氨基酸相似度为69.6%，且其分子中均含有链内的二硫键[6-7,11]（半胱氨酸位置见图1）。PAS（periodic acid-schiff）法与荧光法不能将D. rotundata cv Nwapoko来源的Dioscorin染色[6]，而Con A-peroxidase染色法能够使4种其他来源的Dioscorin显色（D. batatas、D. alata、D. pseudojaponica、D. japonica）[10,12]，说明Dioscorin的糖基化可能与其品种有关，或其所携带的糖链部分比较小，较难染色。Dioscorin与α-碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）的氨基酸序列相似度较高（图1），虽然其α-CA活性部位（图1中△标记）的3个组氨酸中有一个变为谷氨酰胺，但不同来源的Dioscorin仍具有CA活性[7-8,12,14]。圆二色光谱[10,15]与近红外傅里叶变换拉曼光谱[13]结果显示，Dioscorin主要由α-螺旋和反平行β-折叠组成。目前，Dioscorin已经被成功的结晶化，且已得到初步的单晶X射线衍射数据[16]，在不远的将来其三维立体结构（图2）将帮助我们更加深入地了解其多活性机理。

图1 Dioscrin（D. japonica ）与N. gonorrhooeeaaee CA的序列比对Fig.1 Sequence alignment of D. japonica dioscorin and N. gonorrhoea CA

图2 基于N. gonorrhoea CA的Dioscorin结构模型（SWIS-MODEL）Fig.2 Structural model of dioscorin based on its homology with that of N. gonorrhoea CA

3 Dioscorin的生物活性

3.1 α-CA活性

碳酸酐酶是一族含锌酶，主要催化CO2和HCO3-之间的可逆转换，其CO2固定作用对植物和蓝藻的光合成十分重要。在动物中，CA参与体内酸碱平衡调节，离子交换及呼吸作用等过程。CA大致分为5类：α、β、γ、δ与ε，目前的研究主要集中在存在于脊椎动物、细菌、藻类及植物胞浆中的α与存在于高等植物及藻类叶绿体的β上[7,12,17-18]。尽管Dioscorin的α-CA活性部位残基出现了一个错位，但Hou等[8]于1999年首次使用pH-stat法（反应方向为碳酸氢钠脱水方向，使用0.1 mol/L硫酸自动滴定至pH 7.1）及SDS-PAGE溴百里酚蓝活性染色证明了D. batatas Decne来源的Dioscocrin的确具有CA活性。随后，5种其他来源的Dioscorin均被活性染色法证明具有CA活性。但此活性不依赖于Zn而存在，且添加乙酰唑胺（CA抑制剂）或2,6-吡啶二甲酸（锌螯合剂）均不影响Dioscorin的CA活性，说明Dioscorin的CA活性机理可能与传统α-CA不同[12]。Xue等[10]于2012年克隆并在大肠杆菌中表达了Dioscorin（D. japonica），其CA活性保持不变。

3.2 胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor，TI）活性

蛋白类蛋白酶抑制剂广泛地存在于植物王国中，其相对紧凑的抑制结构域能与靶蛋白酶活性部位相互作用，竞争性抑制其与底物的接触，从而降低酶的活性。在植物中，蛋白酶抑制剂参与种子的休眠和萌发过程中内源性蛋白酶活力的调节，抑制昆虫、真菌等外源性蛋白酶以保护植物免受侵害[19-20]。近年来植物来源TI因其具有多种药理活性，如抗炎、抗癌、抗病毒等，引起了广泛关注[21]。Hou等[8]经活性测定（抑制胰蛋白酶对N-benzoyl-L-arginine-4-nitroanilide的水解）、SDSPAGE活性染色及PVDG免疫染色（兔抗38kD红薯TI多克隆抗体）证明了D. batatas Decne来源的Dioscocrin具有TI活性[8]。随后，5种其他来源的Dioscorin均被活性染色法证明具有TI活性[12]。此外，重组Dioscorin（D. japonica）也被证明具有TI活性[10]。

3.3 抗氧化活性

脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）与单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）均是谷胱甘肽-抗坏血酸循环系统中重要的酶，能够保护植物免受活性氧的攻击[22]。Hou等[23]发现D. batatas Decne来源的Dioscocrin接近中性pH值时具有DHAR与MDHAR活性。但经大肠杆菌表达后，两种活性均消失，此现象可能与大肠杆菌表达系统无法表达糖蛋白的糖链有关[10]。此外，还发现D. batatas Decne来源的Dioscocrin能够清除DPPH自由基与羟自由基，且存在剂量依赖关系[24]。为模拟其在体内的消化状况，胃蛋白酶被加入D. alata L.cv. Tainong1来源的Dioscorin，其水解产物的DPPH自由基清除能力随水解时间的延长而增强[25]。通过电脑模拟胃蛋白酶对Dioscorin的水解，4种人工合成的含硫Dioscorin短肽均显示了不同的抗氧化能力，其中KTCGY的抗氧化能力最强[26]。

3.4 免疫调节活性

Toll样受体（TLR）是天然免疫反应中重要的细胞表面模式识别受体，迄今为止人体内已鉴定出了10种TLR[27]。Fu等[28]发现D. alata来源的Dioscorin能够通过TLR4激活NF-κB与MAPKs信号通路，诱导C3H/HeN小鼠骨髓细胞与小鼠巨噬细胞RAW264.7的诱生型一氧化氮合酶（iNOS）与促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β与IL-6）的表达，而在C3H/HeJ小鼠（TLR4基因突变型）中此功能不存在。此外，Liu等[29]发现D. alata cv. Tainong No. 1来源的Dioscorin不仅能够增强RAW264.7细胞的细菌吞噬作用与氧化迸发（oxidative burst）活性，还能够促进BALB/c小鼠肾脏细胞的增殖。为了评价Dioscorin经消化后的作用效果，Liu等[30]将相同来源的Dioscorin饲喂（2.5与20mg/kg·day）给BALB/c小鼠21d后发现：淋巴细胞亚群中B细胞与自然杀伤细胞水平升高；多形核细胞、单核白细胞的吞噬作用与自然杀伤细胞的胞毒性显著增强；脾细胞增殖得到促进，说明此免疫调节作用与黏膜免疫应答相关性较大。经小鼠腹膜注射，D. alata和D. japonica来源的Dioscorin显示出不同的免疫调节效果，其中D. alata来源的Dioscorin能增强淋巴细胞的吞噬作用，而D. japonica来源的Dioscorin对淋巴细胞的增殖更有效果[9]。

3.5 凝集素活性

凝集素（Lectin）是一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，在细胞识别和黏着反应中起重要作用。许多植物凝集素如植物血凝素、刀豆素A等可作为丝裂原，在免疫学中广泛用于促进淋巴细胞的增殖[31]。Gaidamashvili等[15]从D. batatas中纯化出4种蛋白质，其中DB2（占总提取蛋白的50%）被鉴定为A类Dioscorin，且不具有凝集素活性；而另外3种蛋白（DB1、DB3与DB4）均具有凝集素活性。DB3的大亚基由2个31kD的部分经二硫键连接组成，其与B类Dioscorin的氨基酸同源性较高（90%），是DB3凝集素活性的主体。然而，Dioscorin的淋巴细胞增殖（免疫调节）作用与其凝集素活性是否相关还需要进一步验证。

3.6 抗高血压活性

肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）是人体调节血压与体液平衡的关键系统，而血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是此系统的关键酶，负责催化血管紧张素I转化为血管紧张素Ⅱ（具有收缩血管活性），从而使血压升高[32]。Hsu等[33]最先报道了D. alata cv. Tainong No. 1来源的Dioscorin及其酶解（胃蛋白酶）产物均能够剂量相关地抑制ACE，且Dioscorin对ACE为混合非竞争性抑制，其IC50为6.4μmol/L。在随后的实验中，Lin等[34]将相同来源的Dioscorin与其水解物饲喂给自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）：在24h实验中，按40mg/kg体重饲喂一次，蛋白及其水解物均能显著降低SHR的平均压，收缩压与舒张压，且其降低水平与卡托普利（市售降压药）相当；在25d实验中，每天一次按40mg/kg体质量饲喂蛋白，血压在第9天降到最低，且降压效果持续到实验结束。为了评价Dioscorin对人体的作用效果，Liu等[35]经安慰剂对照双盲法人体实验证明，含dioscorin的饮食（140mg）对高血压人群具有血压调节作用，但不排除山药的其他成分在该实验中起到了类似的作用。

3.7 呼吸道上皮细胞保护活性

呼吸道上皮细胞是呼吸道防御病原体感染的第一道屏障，通过3种方式抵御外来病原体侵害：黏膜纤毛的清除功能；细胞间紧密连接调节上皮细胞旁通透性；分泌抗菌成分杀死吸入的病原菌[36]。尘螨提取液不仅是一种过敏原而且还具有胰蛋白酶活性，能够破坏支气管上皮细胞的紧密连接。Ko等[37]发现Dioscorin能够通过维持细胞间紧密连接结构与表达紧密连接相关蛋白（ZO-1，EC与DP）来保护A549细胞不受尘螨提取液侵害，其保护作用可能与其胰蛋白酶抑制剂活性有关。氧化应激会导致呼吸道上皮细胞旁通透性增加。Hsu等[38]发现Dioscorin能削弱过氧化氢引起的G2/M期阻滞，抑制IL-8的分泌，减少过氧化氢诱导的黏附分子的表达，从而起到对A549细胞氧化应激损伤的保护作用，其保护作用可能与其抗氧化与免疫调节活性有关。

4 展 望

山药储藏蛋白Dioscorin拥有很多生物活性，但目前其三维立体结构还未得到破解，其众多活性的分子机理还是未知。期待在不远的将来其三维立体结构能够带领我们更加深入地了解Dioscorin的多活性机理。

因山药产量、种植规模及蛋白提取工艺等多因素的制约，目前并没有山药蛋白产品问世，而山药也只是主要用作鲜食或作为传统中药材使用，附加值不高。在食品行业虽有山药粥、山药饮料、山药雪糕等，但并未形成山药深加工产品的广泛流通。在人们越来越关注健康的今天，随着食品加工技术的不断发展，针对不同人群的山药深加工系列产品必将不断涌现。

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Recent Progress in Yam Storage Protein Dioscorin

GAO Qi1,2, WANG Xiao-wen1, JIA You-feng1, ZHANG Jun-wei1, YU Tang-ying1, XUE You-lin1,*
(1. College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China; 2. Liaoning Administrative College, Shenyang 110161, China)

As a traditional Chinese medicine and a common tuber crop, yam contains many nutritional and health-protective substances, including starch, polysaccharides, phenolic compounds and proteins. Approximately 80% of the total soluble proteins in yam tuber are dioscorins. In this paper, we review the recent progress in research on the extraction of dioscorins from yam and the characteristics and multiple biological activities of these storage proteins, aiming to provide references for further development and utilization of dioscorins from yam tubers.

yam storage proteins; Dioscorin; extraction technique; biological activity

TS201.1

A

1002-6630（2014）11-0299-04

10.7506/spkx1002-6630-201411059

2013-07-25

国家自然科学基金青年科学基金项目（31201285）；教育部留学回国人员科研启动基金项目（教外司留2013693）；辽宁大学大学生创新创业训练计划项目（X201210140017；X201310140020）

高琦（1980—），女，博士研究生，主要从事植物活性成分研究。E-mail：gaoqi0952@163.com

*通信作者：薛友林（1980—），男，副教授，博士，主要从事农产品加工及食物营养研究。E-mail：xueyoulin@lnu.edu.cn