响应面法优化松茸多糖酶法提取工艺及其体外抗氧化性分析

陈炼红，杨丽珠，索化夷，李 键*

响应面法优化松茸多糖酶法提取工艺及其体外抗氧化性分析

陈炼红1，杨丽珠2，索化夷3，李 键4,*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；3.西南大学食品科学学院，重庆 400716；4.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041）

为确定复合酶（纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶）提取松茸多糖的最佳工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步研究，在单因素试验的基础上，以料液比、pH值、酶解时间和酶解温度为影响因素，利用Box-Behnken方法进行四因素三水平试验设计，以多糖提取率为响应值，进行响应面分析；分别用邻苯三酚自氧化法和对DPPH自由基的清除作用测定松茸多糖的体外抗氧化性。结果表明：多糖提取的最佳工艺为料液比1∶40（g/mL）、pH 5、酶解温度35 ℃、酶解时间71 min，松茸多糖的提取率预测值为7.06%，验证值为6.95%，与预测值相对误差为1.56%；松茸多糖对超氧阴离子自由基和DPPH自由基具有较强的清除作用，其IC50值分别为0.565 mg/mL和0.454 mg/mL。因此，复合酶法提取松茸多糖高效、简单，可用作松茸多糖的提取工艺；松茸多糖具有明显的体外抗氧化活性。

松茸；响应面法；多糖；提取工艺；抗氧化性

松茸（Tricholoma matsutak），又名松口蘑，别名大花菌、剥皮菌，属于担子菌纲伞菌目口蘑科口蘑属。松茸富含粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和多种维生素，不但味道鲜美，而且还具有益肠胃、理气化痰等功能，生长在寒温带海拔3 500 m以上的高山林地，生态习性的特殊性使得松茸更加珍贵。多糖是松茸主要的的活性成分，松茸多糖具有显著的免疫调节、抗疲劳、抗炎护肝以及对环磷酰胺诱发损伤的拮抗作用等功效[1]。最近的研究表明，松茸多糖能够抑制人神经胶细胞系（U87）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胰腺导管上皮癌（PANC-1）以及人宫颈癌（HeLa）细胞的生长，且能引起上述细胞S期阻滞，上调p53mRNA表达水平[2]。松茸多糖提取效率和质量对于进一步开发松茸相关保健产品具有重要的意义。本研究利用响应面法对松茸的复合酶法提供最佳条件的选择，提高松茸多糖的得率，并对提取后的松茸多糖进行体外抗氧化能力的测定，旨在对松茸多糖资源的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

松茸（Tricholoma matsutak）采自四川省甘孜草原，烘干磨碎过100 目筛备用。

纤维素酶（15 U/mg） 上海博奥生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（600 U/mg） 北京奥博星生物技术有限公司；果胶酶（500 U/mg） 成都市科龙化工试剂厂。

正丁醇、三氯甲烷、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、柠檬酸、磷酸氢二钠等（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；邻苯三酚、Tris试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 成都迪康生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

400 g多功能粉碎机 永康市小宝电器有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；AL204电子天平（精确至0.000 1 g） 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；AKHL-Ⅲ-24超纯水机 成都康宁试验专用纯水设备厂；XW-80A旋涡混合器、RE-85Z旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；5804R离心机 德国Eppendorf公司；UV-6100型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；磁力搅拌器、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；DHZ-C大容量冷冻恒温振荡器 太仓市试验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 松茸多糖酶法提取工艺[3-6]

干松茸→粉碎→复合酶水解（单因素和多因素）→离心（7 500 r/min，10 min）→取上清液→脱蛋白（Sevag试剂（三氯甲烷-正丁醇（4∶1，V/V）脱蛋白，重复操作4 次）→真空浓缩（旋转蒸发器浓缩多糖提取液至原体积的1/3）→乙醇沉淀（4 ℃低温，体积分数80%乙醇溶液醇沉过夜，棕色絮状粗多糖析出）→离心（参数同上）→沉淀→干燥→定容→测粗多糖含量

1.3.2 标准曲线的制作及多糖含量的测定

采用蒽酮-硫酸法测定多糖含量[7-10]，分别吸取0.04 mg/mL的葡萄糖标准液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以超纯水补至2.0 mL置于比色杯中。分别加入质量分数6%的苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置20 min后于紫外-可见分光光度计620 nm波长处测吸光度，以2.0 mL水按同样显色操作为空白，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

标准曲线回归方程为：A=8.652x＋0.085（x为葡萄糖质量浓度/（mg/mL），A为吸光度），R2=0.997，线性关系良好。

松茸提取液中多糖含量的测定：同样采用苯酚-硫酸法。将提取后经干燥过的多糖用体积分数80%乙醇溶液定容于500 mL容量瓶内，吸取1.0 mL以超纯水补至2.0 mL。分别加入质量分数6%的苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，静置10 min，摇匀，室温放置20 min后于紫外-可见分光光度计490 nm波长处测吸光度。将测定出的吸光度代入葡萄糖标准曲线中便可得到多糖提取液中多糖的含量。按照式（1）可计算出松茸多糖的提取率：

式中：E为松茸多糖的提取率/%；M1为松茸粉质量/mg；M2为依据回归方程计算出的粗多糖质量浓度/（mg/mL）。

1.3.3 松茸粗多糖提取单因素试验[11-14]

将复合酶的条件定为纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶的比例为1∶1∶1，加入的总量为水解液体积的0.2%。在酶添加量一定的条件下，分别考察不同料液比（g/mL）（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、不同酶解时间（20、40、60、80、100 min）和不同酶解温度（30、35、40、45、50 ℃）对松茸多糖提取率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

在上述单因素试验的基础上，选择料液比、pH值、酶解时间和酶解温度为自变量，根据Box-Behnken设计原理[14-15]，进行四因素三水平的响应面分析试验[16-20]，因素水平设计见表1。以松茸粗多糖提取率为响应值，利用Design Expert 8.05软件对数据进行分析，得出最佳酶解工艺条件。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.3.5 松茸多糖体外抗氧化活性实验

1.3.5.1 超氧阴离子自由基清除率的测定[21-23]

分别取不同质量浓度的样品溶液1.0 mL，加入50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）4.0 mL，25 ℃水浴保温10 min，然后加入25 mmol/L的邻苯三酚0.1 mL，混匀，保温5 min，立即加入2 滴10 mol/L的HCl溶液终止反应，读取溶液在波长325 nm处的吸光度。空白组加入蒸馏水1.0 mL代替样液，以VC为对照。按照式（2）计算松茸多糖清除超氧阴离子自由基的清除率：

式中：A0为空白组的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为不加邻苯三酚的样品溶液的吸光度。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率的测定[24-25]

取不同质量浓度的样品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液（0.08 mg/mL）分别置于不同三角瓶中，混匀，反应30 min后在517 nm波长处测定其吸光度，以VC为对照。按照式（3）计算松茸多糖清除DPPH自由基的清除率：

式中：ADPPH为DPPH溶液的吸光度；A样品为加入样品溶液或VC后样品DPPH溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对松茸多糖提取率的影响

图1 料液比对松茸多糖提取率的影响Fig.1 Effect of water/material ratio on the extraction efficiency of Tricholoma matsutake polysaccharides

由图1可知，在pH5.0（pH值用磷酸氢二钠和柠檬酸配制的缓冲液调节）、酶解时间60 min、酶解温度40℃的条件下，当料液比为1∶30时，松茸多糖提取率达到6.57%，之后，随着液体体积增大，多糖得率反而减小，在此料液比条件下松茸多糖的溶解度达到最大，因此采用1∶30的料液比最佳。

2.1.2 pH值对松茸多糖提取率的影响

图2 pH值对松茸多糖提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the extraction efficiency of Tricholoma matsutake polysaccharides

由图2可知，在料液比1∶30、酶解时间60 min、酶解温度40 ℃的条件下，当pH值为3.0时，松茸多糖的提取率最低，溶液的酸度太大抑制了酶的活性；当pH值为5.0时，松茸多糖提取率达到5.75%，之后，随着pH值增大，多糖得率反而减小，这是因为pH值的升高影响了酶与底物的亲和力，破坏了酶的活性，从而造成了多糖提取率的下降[6]。综合考虑， pH值为4.5时最佳。

2.1.3 酶解时间对松茸多糖得率的影响

图3 酶解时间对松茸多糖提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of Tricholoma matsutake polysaccharides

由图3可知，在料液比1∶30、pH4.5、酶解温度40 ℃的条件下，当酶解时间为60 min时，松茸多糖提取率达到6.36%，之后，随着酶解时间的延长，多糖提取率略有下降。当酶解时间太短，酶解不充分，而酶解时间过长也不能显著增加松茸多糖的提取率。综合考虑，酶解时间为60 min时最佳。

2.1.4 酶解温度对松茸多糖提取率的影响

由图4可知，在料液比1∶30、pH4.5、酶解时间60 min的条件下，当酶解温度为40 ℃时，松茸多糖提取率达到6.53%，之后，随着酶解温度的升高，多糖提取率反而减小。当酶解温度升高到一定值时，破坏了酶的活性，多糖提取率减小。综合考虑，酶解温度为40 ℃时最佳。

图4 酶解温度对松茸多糖提取率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of Tricholoma matsutake polysaccharides

2.2 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，以料液比、pH值、酶解时间和酶解温度4 个因素为自变量，以松茸粗多糖提取率为响应值，采用响应面法进行四因素三水平的试验设计，共包括29 组试验方案。试验方案及试验结果见表2，回归分析见表3。

表2 2 松茸多糖提取率的响应面试验方案及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

2.2.1 模型方程的建立与显著性检验

对表2中的数据进行多元回归拟合，获得松茸多糖提取率对编码自变量料液比、pH值、酶解温度和酶解时间的二次多项回归方程：

Y=5.75＋1.02A＋0.045B-0.40C＋0.82D＋0.26AB-0.09AC-0.40AD-0.090BC-0.023BD-0.010CD-0.15A2-0.66B2-0.23C2-0.29D2

对模型进行方差分析（表3），可以看出：P模型= 0.034 2＜0.05，表明模型显著；多糖提取率失拟项P=0.6576，表明失拟不显著，所选用的二次回归模型是适当的；对模型进行回归方程系数显著性检验，得到模型一次项A（P＜0.001）差异极显著，一次项D（P＜0.05）差异显著，表明料液比与酶解时间对多糖提取率有显著影响。

2.2.2 松茸多糖的响应面分析

利用Design-Expert 8.05软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面如图5所示。

图5 两因素交互作用对松茸提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the effects of operating parameters on the extraction efficiency of Tricholoma matsutake polysaccharides

从图5可以直观地看出，各试验因素的交互作用不显著。试验因素中料液比对松茸多糖提取率有显著影响，酶解时间次之。通过对回归模型求解方程，得出松茸多糖的最佳提取工艺为料液比1∶40（g/mL）、pH 5、酶解温度35 ℃、酶解时间71 min，在此提取条件下多糖的最大提取率为7.06%。

2.2.3 验证实验

在上述最佳提取工艺参数下，进行3 组平行实验，所得多糖提取率的平均值为6.95%，与回归方程所得的多糖提取率7.06%相对误差为1.56%。说明回归方程能较真实地反应各因素对松茸多糖提取率的影响，证明用响应面法优化松茸多糖提取率回归模型较可靠。

2.3 松茸多糖体外抗氧化活性分析

2.3.1 超氧阴离子自由基清除能力

图6 松茸多糖对超氧阴离子自 由基的清除率Fig.6 Superoxide anion free radical scavenging effect of Tricholoma matsutake polysaccharides

从图6可看出，在测定的质量浓度范围内，随着松茸多糖质量浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除率也是增大的，在松茸质量浓度达到一定值后，其超氧阴离子自由基的清除率是大于VC的。松茸多糖对超氧阴离子自由基的IC50值为0.565 mg/mL，VC对超氧阴离子自由基的IC50值为0.766 mg/mL。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

图7 松茸多糖对DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging effect of Tricholoma matsutake polysaccharides

从图7可看出，在测定的质量浓度范围内，随着松茸多糖质量浓度的增大，对DPPH的清除率也是增大的，在整个测定的质量浓度范围内，其DPPH自由基的清除率都是大于VC的。松茸多糖对DPPH自由基的IC50值为0.454 mg/mL，VC对DPPH自由基的IC50值为0.663 mg/mL。

3 结 论

使用复合酶法提取松茸多糖，在单因素试验的基础上，以松茸多糖得率为响应值，响应面优化后，得到松茸多糖的最佳提取工艺为料液比1∶40（g/mL）、pH 5、酶解温度35 ℃、酶解时间71 min，在此提取条件下多糖的提取率为6.95%，与预测值7.06%相比，相对误差为1.56%。说明回归方程能较真实地反应各因素对松茸多糖提取率的影响，证明用响应面法优化松茸多糖提取率回归模型较可靠。

松茸多糖的体外抗氧化能力实验结果表明，多糖对不同自由基的清除能力不同，且在一定的质量浓度范围内（0.1～0.6 mg/mL）呈正相关的关系；在一定的质量浓度范围内（0.1～0.6 mg/mL），松茸多糖清除自由基的能力是大于VC的，整个多糖体外抗氧化性的研究都表明了松茸多糖都具有较强的体外抗氧化能力，为今后松茸多糖相关产品的的开发利用提供了一定的参考和依据。

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Response Surface Analysis for the Optimization of Extraction Process for Polysaccharides from Tricholoma matsutake and Antioxidant Activity of the Extracted Polysaccharides

CHEN Lian-hong1, YANG Li-zhu2, SUO Hua-yi3, LI Jian4,*
(1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 4. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Objective: To develop an optimized enzymatic method for extracting polysaccharides from Tricholoma matsutake with a combination of cellulase, pectinase and neutral protease and to evaluate the antioxidant activity in vitro of the extracted polysaccharides. Methods: On the basis of single-factor experiments, a four-factor, three-level Box-Behnken design was utilized for the mathematical modeling of polysaccharide yield as a function of material/water ratio, medium pH and hydrolysis time and temperature. This was followed by response surface analysis of the developed mathematical model. The antioxidant activity of Tricholoma matsutake polysaccharides was determined by pyrogallol autoxidation and free radical-scavenging assay. Results: The optimum condition for the extraction of Tricholoma matsutake polysaccharides were found to be hydrolysis at 35 ℃ for 71 min with a material/solvent ratio of 1:40 (g/mL) at pH 5. Under these conditions, the model-predicted and experimentally measured values of polysaccharide yield were 7.06% and 6.95%, respectively, revealing a relative error of only 1.56% between them. The Tricholoma matsutake polysaccharides had a strong capacity to scavenge superoxide anion (IC50= 0.565 mg/mL) and DPPH free radical (IC50= 0.454 mg/mL). Conclusion: The proposed extraction method is efficient, simple and applicable for the extraction of polysaccharides form Tricholoma matsutakes and the extracted polysaccharides have significant antioxidant capacity in vitro.

Tricholoma matsutake; response surface analysis; polysaccharides; extraction process; antioxidant effect

TS202

A

1002-6630（2014）16-0023-06

10.7506/spkx1002-6630-201416005

2013-11-07

公益性行业（农业）科研专项（201203009）；西南民族大学2014年校课题一般项目（2014NY1302）

陈炼红（1967—），女，副教授，本科，研究方向为民族食品资源开发。E-mail：lianhong_chen@163.com

*通信作者：李键（1967—），男，教授，博士，研究方向为民族食品资源开发。E-mail： lijiangracy@yahoo.com