荧光聚合酶链式反应检测白粿干模拟转基因样品前处理优化

张 冰，王志纯，邵碧英，缪婷玉，彭 娟，陈文炳,*

（1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建 福州 350003；2.厦门塔斯曼生物工程公司，福建 厦门 361023；3.福建省种子总站，福建 福州 350003）

荧光聚合酶链式反应检测白粿干模拟转基因样品前处理优化

张 冰1,2，王志纯3，邵碧英1，缪婷玉1，彭 娟1，陈文炳1,*

（1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建 福州 350003；2.厦门塔斯曼生物工程公司，福建 厦门 361023；3.福建省种子总站，福建 福州 350003）

为提高米制品中转基因成分实时荧光聚合酶链式反应检测的灵敏度与检出率，应用模拟转基因白粿干样品，对影响检测结果的主要因素，包括样品颗粒细度、DNA提取过程中样品在十六烷基三甲基溴化铵裂解缓冲液中温育时间等因素进行优化。结果表明：提取的DNA量在样品颗粒细度与十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间的9种处理组合间都有极显著差异，其中最优条件为样品颗粒细度＞100目、十六烷基三甲基溴化铵缓冲液温育时间＞8 h（过夜）。采用最优前处理组合，样品的主要转基因成分检出限从公认的转基因含量0.01%（m/m）降到0.001%（m/m），检测灵敏度提高10倍，有效提高了米制品转基因成分检测结果的准确性。

米制品（白粿干）；转基因成分；实时荧光聚合酶链反应；检出限

DNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是目前常用的基因标记方法之一，该方法能稳定、精确地扩增（复制）具有物种特异性的DNA片段，作为物种的DNA分子标记，已被广泛应用于物种鉴定、检验检疫与转基因产品的检测[1-6]等领域。实时荧光PCR方法在普通PCR的基础上，增加了靶基因的探针，使用荧光信号判别检测结果，使得该方法的特异性与灵敏度大幅度提高，已经广泛应用于稻米及其制品的转基因成分检测[7-11]。

随着转基因技术的不断发展，被推广应用的转基因生物种类越来越多，2012年全球有28个国家种植了1.7亿hm2的转基因农作物，比2011年增长6%，是1996年的100倍。据估计，2012年全球转基因农作物种子创造的价值达到150亿美元，主要有转基因玉米、大豆、棉花、菜籽及甜菜等[12]。由于转基因产品对人类、动物的健康，生态环境等存在不确定性与潜在风险，许多国家都制定了标识管理等法规[13-14]对转基因产品严加监控。欧盟、日本等对我国出口食品的转基因成分检出是零容忍，2006年9月以来，已有法国、德国、意大利、奥地利和日本等国家因为检出转基因大米成分，对我国出口米制品采取了拒绝入境、撤架、召回等措施，并遭到欧盟食品饲料快速预警系统通报，并就我国输欧盟米制品中的转基因大米成分出台紧急措施[15-17]，对我国米制品实施更加严苛的入境检查。若原料大米因邻近田块转基因水稻的串粉而遭受污染，其米制品中的转基因含量甚微[18-19]，实验室样品制备与DNA提取等前处理稍有不当，就会严重影响检测结果的准确性。对转基因大豆、玉米、油菜等产品的PCR检测，有关标准[20-22]都规定需将样品粉碎至0.5 mm左右；在SN/T 1194—2003《植物及其产品转基因成分检测抽样与制样方法》、SN/T 2584—2010《水稻及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法》中[23-24]，对实验室样品处理只有笼统的表述，特别是大米及米制品样品处理的具体粉碎细度，迄今为止未见确切的报道。

样品的制作以及DNA提取等前处理措施，是PCR检测结果准确与否的重要前提。因此，为降低检测方法的检出限、提高检出率、保证检测结果的准确性、建立规范的技术操作程序，本研究对影响米制品中转基因成分检测结果准确性的主要前处理因素进行分析，采用经过研磨、高温、高压加工处理、转基因检测难度较大的米制品白粿干（也称年糕片）为样品，通过添加转基因大米科丰6号粉末，配制成模拟转基因样品，对样品研磨细度、DNA提取过程中的十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）裂解缓冲液温育时间等前处理方法进行分析与优化，以期有效提高米制品转基因成分实时荧光PCR检测结果的准确性，为建立精准转基因检测方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

非转基因米制品白粿干（片状）为福建省闽侯佳惠食品有限公司送检实验室留样；转基因大米科丰6号样品（转基因大米含量为100%）由福建省农业科学院提供。

三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA，TE）缓冲液（pH 8.0）、超纯水、蛋白酶K、RNA分解酶 上海生工生物工程有限公司；Premix Ex Taq（2×）（Probe qPCR）试剂盒、大米内源基因（GOS）与外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）扩增用的引物与探针[23]大连宝生物科技公司（序列见表1）；CTAB（分析纯） 广东光华化学厂有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，分析纯） 上海天莲精细化工有限公司；Tris-Cl、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

表1 荧光定量PCR引物/探针序列Table1 Primer/probe sequences used in fluorescence PCR

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器公司；圆振筛（分析筛，内径200 mm，高度50 mm） 德国Retsch公司；CR22GII高速冷冻离心机 日本日立公司；移液器、Minispin台式离心机 德国Eppendorf公司；WB14温控摇床 德国Memmert公司；Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析仪 德国Amersham公司；PCR工作台 美国Labconco公司；ABI 7500实时荧光定量PCR仪 美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 模拟转基因白粿干样品制备

每个样品均匀分为4份，称取200 g烘干研磨。非转基因白粿干样品研磨成粉末，分别过50目（滤过颗粒小于270 μm）与100目（滤过颗粒小于150 μm）圆振筛，制成颗粒细度＜50目、50～100目、＞100目3个范围的样品。科丰6号转基因大米样品粉末过筛方法同上。

非转基因白粿干样品粉末分别与颗粒细度相同的转基因大米样品按照不同质量分数进行配制。称取相同颗粒细度的非转基因白粿干样品粉末99.99 g与转基因大米样品0.01 g充分混匀，制成0.01%（m/m）的模拟转基因白粿干样品。以同样的方法制作0.001%（m/m）的模拟转基因白粿干样品。

1.3.2 模拟转基因白粿干样品DNA提取

采用CTAB法[8]提取DNA，称取1 g样品粉末于50 mL离心管中，加入5 mL 20 g/L的CTAB裂解缓冲液，于65 ℃恒温摇床中振荡温育（1、4、＞8 h（过夜）），其他步骤按文献[8]进行，最后将获得的DNA溶于300 øL的0.1×TE缓冲液（pH 8.0）中，充分涡旋后，测定DNA溶液的OD260nm/OD280nm值与质量浓度/（ng/μL）。每份样品重复提取2份DNA。

1.3.3 荧光PCR温度循环与阈值设定

实时荧光PCR反应温度循环程序为：95℃，10 min；95 ℃，35 s；60 ℃，60 s；45个循环。阈值设定原则[25]根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

1.3.4 荧光PCR反应体系

荧光PCR单管反应体积为20 øL，引物与探针等试剂加样量如表2所示。

表2 荧光PCR反应体系Table2 Fluorescence PCR reaction systems

1.3.5 样品前处理对荧光PCR检测的影响

供试白粿干模拟样品的转基因大米质量分数为0.01%，按照1.3.1节与1.3.2节设置的3种颗粒细度与3种CTAB温育时间，共9种处理方法，各提取2份DNA，每份DNA做2个荧光PCR反应，即每个样本做4个PCR反应；共检测4个基因，包括大米内源基因（GOS）与3个外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）；总共进行144管PCR反应，每次（96孔板）实验都设置阳性对照、非转基因大米阴性对照与双蒸水（ddH2O）空白对照各1个，对照不正常时实验数据认为无效。

1.3.6 转基因模拟样品检出率

CTAB温育时间同为＞8 h（过夜）的情况下，对3种不同颗粒细度转基因大米质量分数为0.001%的白粿干模拟转基因样品，各提取24份DNA，每份DNA做2个PCR反应，共48个PCR重复，进行3个外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的检出率测试。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Office Excel 2003进行数据分析，对不同处理条件下样品DNA质量浓度与内源和外源基因的实时荧光PCR检测结果（Ct值）的差异显著性进行方差分析，并估算边际均值图。

2 结果与分析

2.1 样品颗粒细度及CTAB温育时间对DNA提取效果的影响

转基因大米质量分数为0.01%的白粿干样品DNA溶液的质量浓度平均值如表3所示。各个组合样品的DNA溶液OD260nm/OD280nm值都在1.7～1.9范围内，符合PCR检测要求。

由表3可知，在相同的颗粒细度下，提取的DNA质量浓度均随着DNA提取过程中CTAB温育时间的延长而提高，温育时间＞8 h（过夜）条件下提取的DNA质量浓度较其他2个温育时间处理高；在温育时间相同情况下，DNA质量浓度随样品颗粒细度目数的增加而增高，颗粒大小＞100目的样品中提取的DNA质量浓度比其余2种颗粒细度要高；CTAB温育时间＞8 h（过夜）、颗粒大小＞100目的样品提取的DNA质量浓度在9种处理组合中为最高。

表 33 白粿干模拟转基因样品提取的DNA平均质量浓度Table3 DNA average concentrations in simulated transgenic rice cake samples ng/μL

无重复双因素方差分析结果表明：样品颗粒细度与CTAB温育时间对样品DNA提取质量浓度的影响均达到极显著水平（F行=30.27，F列=38.50，F0.01=18.00，P＜0.01）。

2.2 前处理对荧光PCR检测的影响

表4 前处理对白粿干模拟转基因样品4个基因Ct值的影响显著性F检验Tabllee 44 F test of significant effect of pretreatment on Ct values of 4 genes in simulated transgenic rice cake samples

内源基因GOS和外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c荧光PCR测得的Ct值的F检验结果如表4所示，样品在CTAB裂解缓冲液中的温育时间对内源基因GOS和3个外源基因荧光PCR检测结果都有极显著影响；样品颗粒细度（目数）因素对3个外源基因荧光PCR检测结果都有极显著的影响；两因素间的交互作用对内源基因GOS的检测结果有极显著影响，对CaMV35S有显著影响，对NOS、Cry1Ab/c基因影响均不显著。3个外源基因检测结果的估算边际均值如图1所示。

图1 3个基因的估算边际均值图Fig.1 Estimated marginal average Ct values of three genes

结果表明：样品颗粒细度＞100目、CTAB温育时间＞8 h的前处理条件下，Ct值均为最小。因此选择可见样品颗粒细度＞100目和温育时间＞8 h（过夜）为前处理最佳组合。

2.3 样品颗粒细度对白粿干低含量转基因成分检出率的影响

CTAB缓冲液温育同为＞8 h（过夜）的条件下，3个外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的检出率见表5、荧光PCR曲线见图2。样品颗粒细度＜50目时，CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c的检出率分别为66.67%、70.83%、64.42%；样品颗粒细度在50～100目时，3个基因检出率均为87.50%；样品颗粒细度＞100目时，CaMV35S基因检出率为97.92%，其他2个基因检出率均为100%。颗粒细度＞100目的样品转基因成分PCR检测的Ct值平均数（n=48）都在阳性结果判断值（36）以下（表6），说明前处理中的研磨细度对检出率有显著影响，恰当的前处理措施可以使得检出限，即检出率稳定在95%以上的最低检出含量[26]，降低到0.001%，比常规荧光PCR检出限（0.01%[10,27]）降低10倍。

表5 样品颗粒细度对白粿干模拟样品转基因成分检出率的影响Table5 Effect of sample particle size on detection efficiency of transgenic components in simulated rice cake sample%

表6 经最优前处理后的白粿干模拟样品转基因成分CCtt平均值Table6 Average Ct values of transgenic components in simulated rice cake samples after the optimum pre-treatment

图2 经最优前处理后的白粿干模拟样品3个转基因成分实时荧光PCR曲线图Fig.2 Fluorescence PCR curves of three genes in simulated transgenic rice cake samples after the optimum pre-treatment

3 结 论

结果表明：样品颗粒细度与CTAB温育时间对DNA浓度产生的影响均达到极显著水准。颗粒细度＞100目、CTAB温育时间＞8 h（过夜）的条件下，DNA提取效果最佳、浓度最高。CTAB缓冲液温育时间对内源基因GOS和3个外源基因荧光PCR检测结果都有极显著影响；样品颗粒细度对3个外源基因荧光PCR检测结果都有极显著影响；两因素间的交互作用仅对GOS有极显著影响，对CaMV35S有显著影响，而对NOS、Cry1Ab/c基因影响均不显著。3个外源基因检测结果的估算边际均值表明：样品颗粒细度＞100目和温育时间＞8 h（过夜）为前处理最佳组合。在CTAB温育时间＞8 h（过夜）、样品颗粒细度目数＞100目时，转基因大米质量分数为0.001%的模拟白粿干转基因样品的3个外源基因（CaMV35S、NOS、Cry1Ab/c）检出率均在97%以上，而且荧光PCR检测结果Ct平均值都在阳性结果判断值以下。

当置信水平为95%时，样品测定值与零浓度样品（不含待测成分）的测定值有显著性差异即为检出限，实验要求重复20次以上[26]。本研究对添加科丰6号转基因大米质量分数为0.001%的白粿干模拟转基因样品进行3种不同颗粒细度的处理，各重复提取24份DNA，每份DNA做2个PCR反应，共48个PCR重复，结果表明：优化的前处理条件与PCR反应体系能够使荧光PCR方法的检出限从0.01%（m/m）降低到0.001%（m/m），即检测方法灵敏度提高10倍。本研究仅以经过研磨、高温、高压加工处理、转基因检测难度较大的白粿干模拟转基因样品进行方法优化探讨，考察前处理条件对转基因成分定性荧光PCR检测结果的影响，为进一步研究使用转基因大米制作的真正的“转基因大米制品”提供依据与参考；采用更多的转基因食品种类与基因种类作为研究对象，进行荧光PCR精准检测方法的研究。

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Pretreatment Optimization of Simulated Rice Cake Samples for Fluorescence Polymerase Chain Reaction to Detect Transgenic Components

ZHANG Bing1,2, WANG Zhi-chun3, SHAO Bi-ying1, MIAO Ting-yu1, PENG Juan1, CHEN Wen-bing1,*
(1. Inspection and Quarantine Techonology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350003, China; 2. Xiamen Tasman Bio-Tech Co. Ltd., Xiamen 361023, China; 3. Fujian Provincial Seed Station, Fuzhou 350003, China)

In order to improve the sensitivity and detection limits of transgenic components in rice products, pretreatment conditions for DNA extraction including sample particle size and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) lysis buffer were optimized using simulated transgenic rice cake samples. The results showed that the content of DNA had significant differences among 9 treatment combinations of sample particle size and CTAB lysis buffer incubation time. The content of DNA extracted by the combination of sample particle size larger than 100 mesh and CTAB lysis buffer incubation time longer than 8 h (overnight) was the highest. The detection limit of major transgenic components in rice cake samples was reduced from transgenic content of 0.01% (m/m) to 0.001% (m/m), suggesting that the sensitivity of fluorescence polymerase chain reaction (PCR) was improved by 10 times using the optimal pretreatment. The detection accuracy of genetically modified components in rice products was effectively improved as well.

rice products (rice cake); genetically modified ingredients; fluorescence real time-polymerase chain reaction (RT-PCR); limit of detection

TS213.3

A

1002-6630（2014）02-0243-05

10.7506/spkx1002-6630-201402047

2013-07-23

福建出入境检验检疫局科技计划项目（FK2010-28；FK2013-02）

张冰（1988—），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：1273495290@qq.com

*通信作者：陈文炳（1962—），男，研究员，博士，研究方向为农产品、食品分子生物学检测技术。E-mail：621213wbc@163.com