甘肃不同地区绵羊TLR9 基因多态性分析

吕伟丽 张小丽 马小军，2 张国华

（1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）

绵羊的呼吸道疾病主要是由羊肺炎支原体、巴氏杆菌、绿脓杆菌及C 群肺炎链球菌等病原微生物引起的呼吸道传染病，主要以咳嗽、气喘及肺炎为特征，羊患病后生长不良，掉膘，病情严重且得不到及时治疗时会引起羊只死亡。绵羊呼吸道疾病在每年冬春发病，发病率和死亡率均较高，严重影响养羊业的发展［1-3］。随着分子遗传技术的发展，探讨疾病控制的分子机制成为可能。免疫分子的Toll样受体家族（Toll-like receptor，TLRs）的多态性或差异与动物对病原的抵抗力和易感性有着显著的相关［4］。TLR 是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子［5］。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，TLR 可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答［6］。TLR9 是TLRs 中的一员，可能是天然免疫识别微生物机制中对革兰氏阴性菌表达的内毒素-脂多糖应答的受体［5，7］。TLR9 基因与呼吸道疾病抗性相关。本研究对绵羊该基因的遗传多态性进行分析，结合表型观测资料，初步确定易感等位基因和抗性较强的等位基因。研究表明Toll 样受体（TLRs）是识别病原体和激活机体固有免疫的重要组成部分，与增加人对各种疾病的易感性有较大的关系，如艾滋病［3］、麻风病［8］，或者是动物如牛的副结核［1，2］，猪的沙门氏菌病［9］。脊椎动物的免疫系统中的甲基化的CpG 二核苷酸序列，其主要功能是识别侵入机体的细菌等［5］，这种识别PAMP 分子模式的受体称为Toll 样受体9［10］。在小鼠的抗原抗原呈递细胞（APC）中合成含CpG 寡脱氧核苷酸（核苷酸），并模仿细菌的CpG 的核苷酸和诱导生产的细胞因子［10］，如B 细胞和树突状细胞（DC）［11］。据报道，绵羊和黄牛TLR 是蜂窝模式的CpG ODN 诱导，与人类有许多相似之处［12］。然而，这之间有种间差异也有种内差异，牛和羊因CpG 寡核苷酸的类型的不同而导致免疫反应不同，但对其原因缺乏深入了解［13］。有研究表明，面对体外环境（空气灰层较多）和体内环境（细菌入侵）的变化，TLR 配体可能会受到Toll 样受体基因单核苷酸多态性的影响，作出适应性反应，从而导致细菌感染或炎症性疾病的易感性的改变［6］。目前在国内外还未见有关中国绵羊TLR9 基因的研究报道。本研究针对中国绵羊群体，收集表型正常和患有呼吸道疾病的个体基因组DNA样品，开展TLR9 基因的遗传多态性分析。利用已有的绵羊呼吸道病表型观测和对应的基因组DNA 样品为基础，采用有效的SNPs 检测方法PCR-SSCP，检测绵羊TLR9 基因的遗传多态性，通过序列测定确定变异类型，根据表型初步判定易感呼吸道疾病的等位基因。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究在甘肃省山丹县某规模化养殖场采集107 份表型正常的小尾寒羊血液样品；甘肃省永昌县某规模化羊场采集表型正常小尾寒羊血液样品216 份，患呼吸道疾病的绵羊血液样品36 份；甘肃省陇西县某规模化羊场采集表型正常小尾寒羊血液样品104 份，患呼吸道疾病的绵羊血液样品22 份（表1）。每只羊均颈静脉采血10 mL，柠檬酸葡萄糖（ACD）抗凝，-20℃冻存备用。

表1 绵羊样品采集记录

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 采用常规的酚/氯仿提取法，从血样中提取DNA 并溶解于TE 缓冲液，在1%琼脂糖凝胶，200 V 电泳检测后，放于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物设计及PCR 扩增 采用Primer 5.0 引物设计软件，根据GenBank 发表的绵羊TLR9 基因核苷酸全序列（AY859727）设计其核苷酸序列引物（上游引物：5'-TTCGTGGACCTGTCGGAC-3'，下游引物5'-CTGGCTGTTGTAGCTGAG-3'），扩增目的片段约为414 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。

PCR 扩增采用20 μL 的体系，各成分用量：上下游引物个0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，灭菌ddH2O 6.4 μL，DNA-TAQ 预混酶12 μL。PCR 反应条件：预变性95℃ 1 min；变性95℃ 45 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 54 s，35 个循环；最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR 产物的SSCP 检测 取2.5 μL PCR 产物，7.5 μL 变性剂（98%去离子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚蓝、0.5 mol/L 混合而成），经105℃变性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（acr∶bis=37.5∶1），4℃、240 V，电泳24 h，结束后银染法显色。

1.2.4 TLR9 基因测序 SSCP 分析之后，选取不同基因型个体PCR 扩增产物送至上海生工生物基因科技股份有限公司测序。

1.2.5 数据统计分析 用DNAMAN、Dnasp4.0［14］进行核苷酸变异位点、氨基酸变异位点的分析，系统发育树的构建；Megalign［15］、Clustal［7］对所测的绵羊TLR9 基因序列进行同源序列比对分析。

2 结果

2.1 PCR扩增

对采集的绵羊TLR9 基因进行扩增，得到414 bp 的扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带清晰且无杂物（图1），可以进行下一步的SSCP分析。

图1 TLR9 基因扩增产物电泳图

2.2 PCR-SSCP检测结果

PCR 扩增产物经SSCP 分析，所检测的485 只绵羊中共发现4 个等位基因，分别指定为TLR9 的*A、*B、*C、*D。各等位基因的电泳带从1 条到5条不等，结果见图2。

图2 TLR9 基因SSCP 电泳图谱

2.3 绵羊TLR9基因多态位点、等位基因频率与氨基酸差异分析

本研究共确定4 个不同的序列（图3）。在序列分析中，发现了7 个核苷酸多态位点，占分析位点总数的1.69%。其中转换4 个，占核苷酸多态位点的57.14%，包括C/T 转换1 个，G/A 转换2 个，G/T转换一个；颠换3 个，占多态位点总数42.86%。

用绵羊TLR9 部分基因序列推导出氨基酸序列（图4），共有4 个氨基酸位点发生突变，其中单一氨基酸突变位点2 个。B 等位基因的72 bp 处C/T 和A、D 等位基因201 bp 处G/C，G/A 突变，没有引起氨基酸的变化。

2.4 绵羊TLR9基因座位等位基因频率

根据PCR-SSCP 的检测结果，485 只绵羊TLR9基因存在的等位基因频率分布情况（表2）。其中等位基因B 的频率最高，达到51.13%，其次为等位基因 A。在观测的485 只试验绵羊中，表型正常的个体 427 只（健康未患呼吸道疾病），表型异常的58只（患有呼吸道疾病）。进一步分析发现，患呼吸道疾病羊只中等位基因 D 的频率最高（表3）。

2.5 绵羊TLR9基因同源树的构建

为了分析绵羊TLR9 基因的等位基因与其它相应等位基因间的遗传关系，利用DNAMAN 软件对TLR9 基因的序列进行同源树的构建（图5）。所用序列包括本研究获得的4 个单倍型序列，从GenBank下载以下序列参与系统发育树的构建：EF656460，JN377802，HQ717158，HQ717159，HQ717160，JN377803，HQ434578，EF656459，EF656458，NM001011555，AM231305，AM981307，GU451250，AY859727。图5 显示，绵羊TLR9 基因在国内外各个品种之间的同源性非常高，遗传关系很近。

3 讨论

3.1 绵羊TLR9基因多态性

研究表明，由于产生多态性的机制主要是基因突变和转换，所以TLR9 基因多态性可能就是在长期的进化过程中等位基因的积累、融合与分化形成的。适应是形成TLR9 多态性的动因［6］，其多态性表现出明显的适应意义，如抗病力增强，对环境的适应性增强等，这样就会出现有利的选择，群体中的基因频率就会发生改变，有利的基因在群体中逐渐的积累；不利的基因会逐渐的消失。免疫系统的功能是决定家畜适应外界环境能力的因素［16］，由于家畜所处的环境（地理环境和气候环境）的差别较大，为了更好适应所处的环境，机体的免疫系统会表现出丰富的多态性［17］，编码TLR9 最主要功能区的基因也会表现出丰富的多态性。本研究在绵羊TLR9 基因中发现等位基因4 个，多态位点7 个，占序列总长度的1.67%，具有高度的多态性，这与绵羊所处的环境（甘肃省气候干燥，空气中灰尘中）所具有的适应性强，抗病性强的特点一致。

图3 TLR9 等位基因核苷酸序列比对结果

图4 TLR9 等位基因氨基酸序列对比结果

表2 绵羊TLR9 等位基因频率

表3 患呼吸道绵羊TLR9 等位基因频率

图5 TLR9 基因核苷酸序列的同源树

动物TLRs 与疾病的易感性和抗性有关［6］。TLR9 基因多态性和遗传性的功能是防止机体受到疾病的感染。免疫学研究揭示，可以采用免疫遗传标记开展选种工作，以提高畜禽的抗病力［18，19］。在动物的抗病育种中，许多研究表明TLRs 基因可能是一组重要的候选基因，能用于抗病分子的育种实践之中。本研究选择患呼吸道病的绵羊中，D 等位基因的频率最高；未患呼吸道疾病（表型正常）的绵羊中，A、B 等位基因的频率最高，可以初步推断A、B 等位基因具有较强的抗呼吸道疾病的遗传潜力。

3.2 TLR9基因聚类分析

TLR9 基因的同源树图表明，在绵羊的进化过程中，TLR9 基因最早可能来源于它们分歧之前的共同祖先原始序列，这可能是它们对相同病原微生物发生特定免疫反应的有效证据，具有相似性。

4 结论

研究获得4 个TLR9 基因的等位基因，在该区域中发现了7 个SNPs，主要是由点突变形成的，说明绵羊TLR9 基因具有较丰富的多态性。

发现患有呼吸道病个体中等位基因D 的频率最高，在4 个等位基因中都有出现。TLR9 基因多态性与绵羊呼吸道疾病有一定的相关性。

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