大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆及功能分析

李文滨，周失，李永光

（1.东北农业大学大豆研究所，哈尔滨 150030；2.东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆及功能分析

李文滨1,2，周失1,2，李永光1,2

（1.东北农业大学大豆研究所，哈尔滨 150030；2.东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为进一步研究其功能，将大肠杆菌（Escherichia coli）BL21菌株中克隆得到的谷氨酸脱氢酶基因gdhA插入pCAMBIA3301质粒载体上，替换bar基因，构建植物表达载体pCAMBIA3301-gdhA。用该质粒转化烟草（Nicotiana tobaccum）havana425，成功得到转基因植株。对盆栽烟草干旱胁迫，同时取T1代转基因后代叶片使其自然失水7 h。结果表明，与野生型相比，转基因烟草表现出较强的抗旱性，叶片保水力较强。草铵膦试验表明，gdhA基因可显著提高烟草抗除草剂性能。

谷氨酸脱氢酶基因；烟草；抗旱；草铵膦

谷氨酸脱氢酶（GDH）是生物界中广泛存在的一种多聚酶，其催化反应为：NH4++α-酮戊二酸+ NAD（P）H→谷氨酸+NAD（P）+[1]。在植物生长发育过程中，氨的同化作用非常重要。谷氨酰胺和谷氨酸为植物体内重要含氮化合物的合成提供所需的氮[2]。谷氨酰胺合成酶（GS）在氮代谢过程中起作用，是重要解毒酶，可解除氨基酸降解、光呼吸及硝酸盐还原释放出铵毒性，草铵膦（Glufosinate，PPT）作用的靶酶为GS[3]。在PPT处理植物组织后，抑制GS活性，打破植物体内稳定的氮循环，最终可致植物死亡。同时，GDH通过另一个途径催化谷氨酸合成，维持植物体内氮循环稳定，这可能是GDH提高植物抗草铵膦能力的原因。草铵膦虽能抑制生物体内GS，但不能进入哺乳动物血液和脑组织，所以应用草铵膦安全[4]。

已有报道植物在高温、干旱、高盐、污染以及病原菌侵染等逆境条件下都会造成GDH活性升高，其原因可能在逆境环境中容易造成植物体蛋白质降解，释放出大量的铵引起植物中毒[5]。而组织中铵含量的显著上升，诱导NADH-GDH活性上升，使NADH-GDH在铵同化中所起的作用加强，以减轻植物因铵的过量积累造成的伤害，起到保护作用[6]。同时它在植物受到水分胁迫等状况下表达[7]，能够提高植物对干旱的耐受性。已证实低等单细胞生物中的GDH对底物氨的Km值仅为0.02 mmol·L-1，而高等植物中GDH催化底物却需要很高的Km值，约10～80 mmol·L-1，可认为低等单细胞生物GDH具有更高的氮同化能力。将大肠杆菌（Escherichia coli）strK12菌株中的gdhA基因克隆并转入烟草和玉米中，都出现产量提高，细胞内脯氨酸、可溶性糖浓度增加，抗旱能力较强的现象。在水分胁迫时，植物体内脯氨酸和可溶性糖含量增加[8]，对于大肠杆菌（Escherichia coli）strK12菌株中gdhA基因提高植物抗旱能力的原因可能在于一方面提高植物体内氨基酸和可溶性糖含量，另一方面调节气孔开合的机制和植物体水分利用率以减少失水量，同时根结构的改变更利于其从土壤中吸水。

为利用谷氨酸脱氢酶基因的抗除草剂和抗逆性，本研究从大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中克隆出gdhA基因，并将其与组成型启动子CaMV 35S融合，构建植物表达载体pCAMBIA3301-gdhA通过农杆菌介导转入烟草。结果表明，gdhA基因提高了烟草抗除草剂和抗旱的能力，可为农作物遗传转化和抗旱基因工程研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌（Escherichia coli）BL21，植物表达载体pBI3301，农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，烟草品种havana425，35S：bar烟草均由东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 表达载体构建与叶盘法转化烟草

根据GenBank上查找大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中的gdhA基因序列设计引物，引物设计如下：

PCR反应条件为：94°C预变性5 min，94°C变性30 s，50.7°C退火30 s，72°C延伸30 s，40个循环，72°C终延伸10 min。

用XhoⅠ单酶切质粒pCAMBIA3301，将克隆并测序正确的目的基因与载体连接，构建重组载体pCAMBIA3301-gdhA（见图1），冻融法转化发根农杆菌，通过叶盘法转化烟草。

图1 pCAMBIA3301-gdhA表达载体图谱Fig.1 pCAMBIA3301 plasmid vector

1.2.2 再生植株PCR鉴定

用SDS法提取转基因烟草总DNA，Trizol法提取总RNA，反转录后PCR，PCR呈阳性的植株进行后续试验。

1.2.3 除草剂抗性鉴定

取10 μL草铵膦溶液（浓度呈梯度）点状涂抹在转gdhA基因烟草、转bar基因烟草和野生型havana425烟草自上而下第3片展开叶上，5 d后观察叶色变化。

1.2.4 离体叶片保水性试验

取PCR检测呈阳性的转35S：gdhA基因的烟草植株和野生型烟株形态大小较一致的生长状态良好叶片，使用叶面积测量仪测量叶面积后，置于滤纸上，在室温条件下使其自然失水7 h，每隔0.5 h称量一次叶重，记录叶片失水情况，计算单位叶面积累积失水量。每组3次重复。

将失水后的叶片在湿滤纸上复水0.5 h后，用镊子撕取下表皮，显微成像系统下观察下表皮上的气孔器和气孔大小。观察10个视野，统计气孔密度，求平均值，并用目镜测微尺测量下表皮上气孔器和气孔长宽。

每组用直径8 mm的打孔器取15个叶盘，用去离子水将其淹没，真空泵抽气20 min，电导率仪测初试电导率（S1），然后置沸水浴中20min，冷却后于室温测终电导率（S2）。相对电导率（%）=S1/S2×100%。

1.2.5 盆栽抗旱试验

将烟苗移栽至土中以后定量浇水，约40 d后停止浇水，自然干旱20 d，每隔5 d取一次样，测定脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和SOD值，测定方法参见文献[9]。

2 结果与分析

2.1 转基因烟草鉴定

2.1.1 转基因植株PCR鉴定

为验证gdhA基因是否已整合到基因组中，提取具有草丁膦抗性的T0代烟草植株DNA，以总DNA为模板、gdhA基因引物进行PCR扩增（见图2）。

同时以总RNA反转录之后得到的cDNA为模板进行半定量PCR扩增（见图3），表明该基因在植物体内正常表达。T0代共获得14株烟草植株，最终确定9个株系为转基因阳性植株。

2.1.2 转基因阳性植株草铵膦抗性确定

为验证gdhA基因对烟草对于草铵膦抗性的影响，将其与常用的bar基因作比较。在35S：gdhA烟草-12株系和-13株系、35S：bar烟草和野生型烟草正常生长的T1代植株中各随机选取10株，将草铵膦配制成如图4所示6个浓度的溶液，点状涂抹于从上向下数第3片展开叶，35S：gdhA烟草、野生型和35S：bar烟草涂抹同样的梯度，5 d之后观察，发现草铵膦浓度在300 mg·L-1时野生型已明显黄化，35S：bar烟草在500 mg·L-1浓度时略微变黄，而转基因叶片在600 mg·L-1浓度时几乎没有变化（见图4）。说明转gdhA基因烟草对草铵膦的抗性有显著提高。

图2 转基因烟草PCR产物电泳Fig.2 Product of PCR amplification ofgdhA-transgenic tobacco

图3 转基因烟草半定量PCR产物电泳Fig.3 Product of semi-quantitive PCR amplification of transgenic tobacco

2.2 离体叶片保水性分析

2.2.1 离体叶片保水力测定

叶片保水力能在一定程度上体现植物的抗旱性。本研究中，在剪叶7 h后，野生型叶片萎蔫，叶面积明显缩小，叶色黯淡；转基因叶片萎蔫较轻，叶面积缩小但没有野生型变化明显，叶色较亮（见图5）。叶片在剪叶后1 h内失水速率较快，失水量大；2 h后失水速率减慢，但累积失水量不断增加（见图6）。转基因烟草和野生型相比，在开始1 h内，野生型明显比转基因叶片失水快，2 h后失水速率减慢，但从图中折线趋势看，野生型叶片仍比转基因的失水快。说明转35S：gdhA基因可提高烟草叶片保水性能。

图4 转基因烟草叶片对草丁膦抗性鉴定Fig.4 Resistance of transgenic tobacco to glufosinate

图5 自然失水前后的叶片Fig.5 Leaves around the natural water loss

图6 单位叶面积累积失水量Fig.6 Accumulative water loss per unit leaf area

2.2.2 离体叶片气孔观察

为分析转基因烟草叶片保水性能与组织器官特异性的关系，分析做保水性试验的同一片叶子气孔密度和大小（见图7）。gdhA烟草叶片的下表皮气孔密度为25.8个/视野，而野生型的为36.6个/视野，gdhA叶片的气孔密度小于野生型。表明转gdhA基因烟草的下表皮气孔数明显减少。

图7显示，转gdhA烟草和野生型相比，下表皮气孔较长，气孔长宽比较大；下表皮气孔器较长，宽度较小，气孔器长宽比较大，气孔开度小，说明转基因烟草的气孔开度小于野生型。

本研究中，在盆栽失水后，野生型烟草丙二醛含量总体呈增加趋势，随着胁迫时间的延长，含量差异越发明显（见图8-A），而转基因烟草的丙二醛含量总体保持在一个水平。在胁迫20 d之后，野生型烟草丙二醛含量上升趋势明显高于转基因烟草，表明转基因烟草比野生型烟草的细胞膜受损程度低，抗旱适应性比非转基因烟草植株强。

在干旱胁迫后，转基因烟草仍保持绿色，生长状态良好，而野生型烟草叶片几乎全部黄化萎蔫，仅有少数叶片仍保持绿色（见图9）。说明转基因烟草抗旱性得到显著提高。同时转基因烟草和野生型烟草可溶性糖含量及脯氨酸含量都有所升高，但是野生型烟草上升趋势明显高于转基因烟草（见图8-B、C），可能转gdhA基因烟草的抗旱调节通过其他途径完成。干旱处理后，野生型烟草的SOD活性迅速升高，上升速率明显高于转基因烟草（见图8-D）。

图7 离体叶片下表皮气孔观察Fig.7 Observing stoma in lower epidermis

图8 干旱胁迫对烟草生理指标的影响Fig.8 physiological indexes in drought stress

图9 干旱胁迫后的转基因烟草和野生型烟草Fig.9 Drought stress of transgenic tobacco

3 讨论与结论

烟草基因具转化技术简单、效率高、速度快等特点，在许多未知基因功能鉴定、基因各调控元件作用的研究中，往往被作为外源基因遗传转化的模式植物，甚至被用作生物反应器。前人已证明gdhA基因具有诸多功能。GDH有六聚体也有四聚体的报道，GDH在催化反应的过程中需要辅酶参与，需要NADPH的GDH主要存在叶绿体中，而需要辅酶NADH的GDH存在于线粒体中，主要参与光呼吸作用，所以对以NADH为电子受体的GDH研究较为深入。NAD（H）-GDH由六个亚基组成，亚基主要有两种类型α和β。β亚基普遍存在于植物体的所有结构里，但并不总是能检测到α亚基，据此推测其生理功能不尽相同[13]。Oaks等分离出玉米茎中的线粒体，并发现能够单独合成谷氨酸，认为GDH在植物中主要起合成谷氨酸的作用，是与GS-GOGAT循环同时存在的一种铵同化途径[14]。Fox等研究胡萝卜悬浮细胞，发现当细胞对氨需求量较大时，GDH活性较低，当培养基中较缺乏碳源时GDH活性最高，在缺乏碳源时，GDH主要起分解代谢的作用[15]。GDH在植物缺乏碳源时起分解作用，为植物提供碳源，而当氮源过量时起到同化铵的作用。由于已明确植物体内主要的铵同化途径是GSGOGAT，推测GDH可能主要在植物处于逆境或衰老过程中发挥作用。已有报道植物在高温、干旱、高盐、污染以及病原菌侵染等逆境条件下都会造成GDH活性的升高，其原因可能在逆境环境中容易造成植物体蛋白质降解，释放出大量的铵引起植物中毒，此时GSGOGAT途径受到限制，所以GDH在缓解植物铵中毒的过程中发挥主要作用[5]。

为了验证本试验所克隆的大肠杆菌BL21菌株中的gdhA基因在其他物种中能否正常表达、表达产物是否具有谷氨酸脱氢酶活性以及在转基因植株中的抗旱、抗除草剂作用中的生理功能，为下一步gdhA基因转化农作物并获得抗旱新种质提供基础。本试验首次从大肠杆菌BL21菌株中克隆gdhA基因，并将其导入烟草havana425中，主要从gdhA的抗旱性及抗除草剂性方面分析，结果表明与野生型相比较，转基因烟草气孔较少，在自然失水后气孔关闭情况较好；转基因叶片具有更高的保水力。转基因烟草叶片在涂抹500 mg·L-1草丁膦的情况下仍保持绿色，无变化，与35S：bar烟草相比抗性有所提高。试验结果初步证明，转gdhA基因烟草植株的抗旱性有所提高，可能与谷氨酸脱氢酶的铵同化作用有关，在植物遭到干旱胁迫时，谷氨酸脱氢酶活性会显著提高，也可能是因为转gdhA基因的作物具有较高的水分利用率，但水分利用率是否可以作为植物抗旱指标目前仍存争议。其他胁迫条件如盐胁迫、低温胁迫对转gdhA烟草的影响尚待深入研究。谷氨酸脱氢酶的表达状况受胁迫条件的影响，因此gdhA基因在不同胁迫条件下发挥的具体作用，将是今后研究方向。

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Cloning and functional analysis of glutamate dehydrogenase gene
(gdhA)inE.coliBL21

LI Wenbin1,2,ZHOU Shi1,2,LI Yongguang1,2
(1.Soybean Research Institute,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Soybean Biology of Chinese Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Glutamate dehydrogenaseis the main oxidative deamination enzymein vivo.In order to further study its function,Glutamate dehydrogenasegene cloned inE.coli(Escherichia coli)BL21 was inserted into pCAMBIA3301 plasmids carrier to replace the bar gene.The transformed tobacco(Nicotiana tobacum)havana425 using the plasmid was obtained.Drought stress to pottedNicotiana tabacumand leaf water retention capacity test was investigated.Blades of T1generation of transgenic offspring naturally dehydrate for 7 h.The results showed that transgenic-gdhANicotiana tabacumshowed higher resistance to drought and higher water retention capacity than that of the non-transgenicNicotiana tabacum.The glufosinate test showed that transgenic-gdhANicotiana tabacumshowed higher resistance to herbicide.

gdhA;Nicotiana tabacum;drought resistance;Glutamate dehydrogenase;glufosinate

S572

A

1005-9369（2014）01-0053-06

2013-03-28

农业部转基因重大专项（2013ZX08004-001，2013ZX08004-002）

李文滨（1958-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为大豆遗传育种和生物技术。E-mail:wenbinli@yahoo.com

时间2014-1-9 22:50:51[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140109.2250.018.html

李文滨,周失,李永光.大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆及功能分析[J].东北农业大学学报,2014,45(1):53-58.

Li Wenbin,Zhou Shi,Li Yongguang.Cloning and functional analysis of glutamate dehydrogenase gene(gdhA)inE.coliBL21[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(1):53-58.(in Chinese with English abstract)