甜菜叶片中Rubisco纯化及其多克隆抗体的制备

李彩凤，刘洋，越鹏，赵丽影，陈业婷，洪鑫，徐影

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

甜菜叶片中Rubisco纯化及其多克隆抗体的制备

李彩凤，刘洋，越鹏，赵丽影，陈业婷，洪鑫，徐影

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

通过(NH4)2SO4分级沉淀、凝胶层析和离子交换柱收集等步骤，优化甜菜叶片中Rubisco的提取、纯化方法，使Rubisco纯化倍数达到7.7；经Native-PAGE显示为一条带，纯度达到90%以上，测定其全酶分子质量为540 ku；SDS-PAGE显示为存在两个亚基，分子质量分别为50和14 ku。通过免疫白兔，制备Rubisco的多克隆抗体，并经双向免疫扩散法检测，抗体效价超过1∶32。可为今后Rubisco酶学特性的进一步研究及免疫电镜细胞学定位奠定基础。

甜菜；Rubisco；纯化；多克隆抗体

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶，ri⁃bulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）（EC 4.1.1.39）是光合碳同化作用过程中的关键酶[1]，广泛分布于具有光合功能的细胞器中[2]，由于Rubisco对叶片光合作用意义重大，占叶片中总蛋白含量比例50%，学者从水稻、烟草、小麦等多种大田作物中提取并纯化得到Rubisco的活化酶（RCA），并对其分子生物学特性有一定了解[3-4]。Rubisco活化酶是一种核编码的叶绿体蛋白，由核基因控制合成，在细胞质中完成。该酶通常由45和41 ku两种亚基组成，6聚体，分子质量为250 ku[5]。但有关甜菜Rubisco的提取纯化及其相关的分子质量方面的研究鲜有报道，尤其对Rubisco多克隆抗体的制备未见报道。本研究通过（NH4）2SO4分级沉淀，结合层析技术对甜菜叶片中的光合关键酶Rubisco进行提取和纯化，并制备多克隆抗体，为今后Rubisco酶学特性的进一步研究及免疫电镜细胞学定位如胶体金标记，以确定其细胞中的位置和含量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为甜研七号二倍体纯系。

1.2 Rubisco提取、纯化及纯度检测方法

Rubisco的提取（4℃）：取新鲜甜菜叶片50 g，加入预冷的Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.8）提取液100 mL，内含10 mmol·L-1EDTA；20 mmol·L-1MgCl2；0.5%Glycolic；5 mmol·L-1DTT；10 mmol·L-1抗坏血酸和1%可溶性PVP。在4℃层析冷柜内匀浆2～3 min，匀浆液经4层纱布过滤，并11 000 g离心10 min，收集上清液即为粗酶提取液。

Rubisco的纯化（4℃）：将上述提取液，于55℃水浴恒温保温5 min，并用冷水浴迅速冷却到室温，再经35%～55%饱和（NH4）2SO4分级沉淀，收集沉淀物，该过程在4℃层析冷柜中进行，溶解于柱平衡缓冲液（25 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1NaCl；0.5 mmol·L-1EDTA）中，溶液经Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐，用柱平衡缓冲液平衡和洗脱，收集到的蛋白峰部分再上Q-Sepharose H.P离子交换柱，先用柱平衡缓冲液平衡，后用0～0.5 mol·L-1NaCl的柱缓冲液梯度洗脱，洗脱速度为18～20 drop·min-1，每2 mL收集一管，收集蛋白质峰进行纯度鉴定。以上各个步骤均进行留样以备进行电泳检测纯度差异。纯化仪器采用ÄKTA prime plus蛋白层析系统（GE Healthcare USA），层析柱（Sephadex G-25凝胶层析柱HiTraptmDesalt⁃ing；Q-Sepharose H.P离子交换柱HiTrap Q H.P）均为预装柱。

Rubisco的纯度检测：①Native-PAGE，方法参照文献[6]：7.5%分离胶，4.5%浓缩胶，上样量15 μL，在0.75 mm厚的胶板上，70 mA运行10 min左右，转用140 mA运行1 h，直到溴酚蓝指示带到达底部，考马斯亮蓝R-250胶体染色后，采用常规脱色法脱色。②SDS-PAGE方法参照文献[7]，有改动：11.98%分离胶，4.38%浓缩胶，上样量5 μL，70 mA电压10～15 min后，140 mA电压1 h，直到溴酚蓝指示带到达底部，采用胶体考马斯亮蓝R-250染色，脱色方法同Native-PAGE。③紫外（UV）吸收法[8-9]于Cary50型紫外/可见分光光度计分别测定260、280 nm吸收值，根据经验公式：蛋白质质量浓度（mg·L-1）=1.45A280-0.74A260。

1.3 Rubisco多克隆抗体制备及效价检测方法

试验以健壮新西兰白兔作为接种对象，购于哈尔滨科隆实验动物服务中心，在实验室环境下以兔粮饲喂1周，待其情绪稳定后，参照陈雅惠的方法进行免疫接种[8]。

采用双向免疫扩散法：配制1%琼脂糖（pH 8.6，50 mmol·L-1巴比妥）10 mL，于微波炉里加热，趁热（约50℃）将约4 mL融化的琼脂糖倒在7.5 cm×2.0 cm规格的载玻片上，待琼脂糖凝固后，打梅花型孔，孔径3 mm，周围孔与中间孔的距离5 mm。采用二倍稀释法稀释抗血清，将稀释好的抗血清依次加入到外周孔内，中心孔加原浓度的抗原，每孔20 μL。加样后放入密闭湿盒中，在37℃温箱内保温过夜。然后取出琼脂糖板，用考马斯亮蓝R-250染色液染色，检测抗体孔与抗原孔间有无沉淀线形成，并以抗血清稀释倍数最高的一孔稀释度作为被测抗血清的效价。

2 结果与分析

2.1 Rubisco的提取、纯化及纯度检测

匀浆液经过（NH4）2SO4分部沉淀，后溶于柱平衡缓冲液后，上Sephadex G-25进行凝胶层析脱盐，如图1所示。

收集蛋白峰，再上Q-Sepharose H.P，以0～500 mmol·L-1NaCl的柱缓冲液梯度洗脱，并收集蛋白峰（见图2）。

各部均经紫外（UV）吸收法进行蛋白浓度测定，纯化结果如表1所示。

经过3步纯化后，Rubisco比活力达到1.08 μmol CO2·min-1·mg-1protein，纯化倍数达到7.7倍，回收率接近50%。

将纯化过程中的酶液进行Native-PAGE电泳，结果见图3。

图1 Sephadex G-25凝胶层析Fig.1 Pattern of Gel permeation chromatography with Sephadex G-25

图2 Q-Sepharose H.P离子交换层析Fig.2 Pattern of ion exchange chromatography with Q-Sepharose H.P

表1 甜菜叶片Rubisco的纯化步骤Table 1 Purification steps of sugar beet leaves Rubisco

图3 Rubisco的Native-PAGE电泳Fig.3 Native-PAGE of Rubisco

由图3可知，各步纯化其电泳条带逐渐变浅，说明杂蛋白的含量逐渐减少。Native-PAGE显示最终纯化的酶仅一条带，估测其分子质量为540 ku，且经紫外分光光度法测定，A280/A260=1.14，即核酸含量＜2.5%，认为其纯度达90%以上；且Rubsico浓度为2.5 mg·mL-1左右，可作为抗原进行免疫试验。同时将纯化后的酶进行SDS-PAGE电泳，结果见图4，显示甜菜叶片中的Rubisco存在两种亚基，其分子质量估算分别为50和14 ku。

2.2 Rubisco多克隆抗体的制备及效价检测

将1 mL纯化后Rubisco酶液（已稀释至1 mg·mL-1）与等体积弗氏完全佐剂及0.1 mL的灭活卡介苗（75 mg·L-1），在无菌条件下将注射滴管中部快速混匀、乳化后，采用四足掌注射法（每足掌0.5 mL）对新西兰白兔进行免疫。1周后采用Rubisco-弗氏不完全佐剂（总量2 mL，不加卡介苗）进行加强免疫；7 d后用同样方法采用Rubisco-弗氏完全佐剂免疫；并取耳缘静脉血1 mL作抗体检测，发现抗体效价不理想，在第2天从耳缘静脉注射0.2 mL血清抗原（不含佐剂）加强免疫；1周后进行1次加强免疫，7 d后又取耳缘静脉血1 mL，检测抗体形成情况见图5，抗体孔和抗原孔之间出现沉淀线，说明形成抗体，进一步进行效价检测发现在1∶32孔与抗原孔间有沉淀线形成，即抗体效价达1∶32（见图6）。

图4 Rubisco SDS-PAGE电泳Fig.4 SDS-PAGE of Rubisco

图5 双向琼脂扩散Fig.5 Double agar diffusion map

图6 双向免疫扩散法检测效价Fig.6 Detect the titer by double immuno diffusion

3 讨论

提取纯化酶时，除要考虑提取介质的pH、离子强度及温度等对蛋白质影响较大的常规因素外，还应该对蛋白水解酶、核酸抑制酶、稳定蛋白象及酶活性的还原剂及金属离子等依不同的提取目的酶的性质予以考虑，注意提取时间对酶活影响较大的因素。

目前提取介质都采用Tris-HCl缓冲体系，内含蛋白水解酶抑制剂（EDTA）及抗蛋白质疏基氧化剂，加入适量MgCl2以对离子浓度进行调节，Mg2+可对Rubisco活化；提取介质中含有高浓度NaCl，对后期处理不利，加入β-ME，挥发性较大，对身体有害，不利于试验操作。李卫芳等[3]、陈相辉[9]采用方法虽然纯化效果较理想，但由于含有12.5%甘油，使操作过程中液体粘滞，不利于在机器上操作；卓敏采用的提取介质含有0.5%Glycolic及0.01 mol·L-1抗坏血酸，此法条件较为温和，根据几次试验结果表明，其提取效果要优于其他两种介质，本试验采用此提取介质[10]。由于试验样品量较大，参照王维光等方法[11]，加入保温步骤（在试验基础上调整到55℃），经检测，该步骤能极大的去除Rubisco粗酶液中其他蛋白质及水解酶，虽然损失掉部分纯酶，但使得后面纯化步骤精度提高；通过多次验证，提取系统中加入ATP效果不明显，本试验中未加入ATP；同时因试验材料不同（原方法其材料为水稻叶片），根据多次试验尝试及综合三种提取液效果，把pH调到7.8。

层析柱一般采用Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐，再上Sepharose系列阴离子交换柱，此时酶液的纯度对于Rubisco非抗体类目的蛋白，已达一般试验要求，Makino等经亲和凝胶柱再次浓缩[12]，虽纯度有所增加，由于操作时间过长，对酶活产生不利影响。

目前国内关于叶片Rubisco纯化基本见于水稻，小麦及烟草等作物，本试验对于甜菜叶片Rubisco提取及纯化尚未见报道。在综合借鉴其他试验基础上，结合甜菜材料自身特征，设计甜菜叶片Rubisco提取及纯化试验方案，即叶片在提取介质的保护下经匀浆，经35%～55%饱和硫酸铵分级沉淀，溶解后，溶液经Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐，再上Q-Sepharose H.P离子交换柱，最终得到较理想的纯酶，本试验过程是在ÄKTA prime plus蛋白层析系统下进行，重复性较好，较之以往采用的分布收集器收集更方便、快捷，且精度较高。

由于目前未见关于甜菜叶片Rubisco抗体制备研究，采用兔作为接种对象，经过4次加强免疫，得到多克隆抗体。对于抗体效价检测方法，目前主要有ELISA定量测定及免疫沉淀法，虽然ELISA定量测定灵敏度相对较高，且操作规范化，适于系列检测，但试验相对复杂，对于二抗的活性要求较严格，对试验技术水平要求较高；而免疫沉淀法，特别是双向免疫扩散法，具有试验简便灵活，干扰因素少，精度对于多克隆抗体效价的检测已足够达到试验要求；经过琼扩检测合格的抗体，一般能通过ELISA定量测定。因此，采用双向免疫扩散法，经检测效价高于1∶32，说明此方法应用于甜菜可行。

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Rubisco purification and preparation of polyclonal antibody in sugar beet(Beta vulgarisL.)leaves

LI Caifeng,LIU Yang,YUE Peng,ZHAO Liying,CHENG Yet- ing,HONGXin,XUYing
(SchoolofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

The methods of Rubisco extraction and purification from sugar beet leaves were optimized through fractional precipitation of(NH4)2SO4,gelchromatography and ion exchange.The purification factor of Rubisco reached 7.7 folds;Native-PAGE shown as one band and purity above 90%,measured full enzyme molecular weight as about 540 ku;SDS-PAGE shown as two bands,which meant two subunits in existence,the molecular weight were about 50 and 14 ku.Prepared Rubisco polyclonal antibody through immunization experiment with white rabbits,then detected by double immunodiffusion experiment,antibody titers shown over 1∶32.This study laid the foundation for further research of Rubisco characteristics and the immune electron microscopy cytology positioning in the future.

sugar beet；Rubisco；purification；polyclonal antibody

S435.663；S566.3

A

1005-9369（2014）04-0036-05

2013-04-02

国家自然科学基金项目（30771276）

李彩凤（1965-），女，教授，博士，研究方向为作物生理。E-mail：caifeng-li@163.com

时间2014-4-21 13:23:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1323.018.html

李彩凤,刘洋,越鹏,等.甜菜叶片中Rubisco纯化及其多克隆抗体的制备[J].东北农业大学学报,2014,45(4)∶36-40.

Li Caifeng,Liu Yang,Yue Peng,et al.Rubisco purification and preparation of polyclonal antibody in sugar beet(Beta vulgarisL.)leaves[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶36-40.(in Chinese with English abstract)