真菌性角膜炎的实验室快速诊断方法分析

赵志伟+张蕴莉

【摘要】 目的：探讨真菌性角膜炎快速而有效的临床实验室诊断方法。方法：对2012年6-12月53例临床疑似真菌性角膜炎患者送检的角膜刮片标本，同时进行墨汁-KOH湿片法镜检、荧光染色镜检和真菌培养。以真菌培养为诊断金标准，对墨汁-KOH湿片法与荧光染色法进行方法学比较。结果：32例真菌培养阳性标本，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%，荧光染色28例阳性，阳性率为87.5%，两者阳性率比较差异有统计学意义（字2=6.125，P=0.025）；两种涂片镜检共为阳性的20例，共为阴性的4例。结论：荧光染色法镜检可以提高真菌性角膜炎的阳性诊断率，是真菌性角膜炎快速、简单、有效的临床实验室诊断方法。

【关键词】 真菌性角膜炎； 墨汁-KOH湿片法； 荧光染色法

Analysis of Laboratory Rapid Diagnostic Method of Fungal Keratitis/ZHAO Zhi-wei，ZHANG Yun-li.//Medical Innovation of China，2014，11（01）：075-077

【Abstract】 Objective：To study the rapid and effective clinical laboratory diagnostic methods of fungal keratitis.Method：Specimens of 53 clinical suspected patients with fungal keratitis from June 2012 to December 2012 were selected， for the ink - KOH wet method microscopy， fluorescence staining microscopy and fungal culture at the same time. Fungus culture as the diagnostic gold standard， the results of ink - KOH wet method microscopy and fluorescent staining microscopy were compared.Result：In 32 cases of positive specimens of fungal culture， 20 cases were positive in ink - KOH wet microscopy， the positive rate was 62.5%， 28 cases were positive in fluorescent staining microscopy， the positive rate was 87.5%， Two positive rate comparisons difference was statistically significant （字2=6.125， P=6.125）. There were 20 cases both kinds of smear microscopy were positive， 4 cases were both negative.Conclusion：The fluorescence staining microscopy can improve the positive diagnosis rate of fungal keratitis， it is a kind of rapid， simple and effective method of clinical laboratory diagnosis.

【Key words】 Fungal keratitis； Ink-KOH wet method； Fluorescent staining method

First-authors address：The Central Hospital of Jinzhou City，Jinzhou 121000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.01.036

真菌性角膜炎是由镰刀菌、曲霉菌、头芽孢菌和酵母菌等致病性真菌引起的感染性眼病，常伴有角膜溃疡及视力下降，由于早期不易诊断，常造成误诊、漏诊，导致患者因治疗不当而失明[1-3]。因此，采用快速而有效的实验室方法来确定病因，对指导临床正确与及时的治疗至关重要。锦州地处辽宁西部，气候干燥，玉米是当地主要农作物，夏秋农忙季节由于农作物枝叶刮伤造成的真菌性角膜炎比较常见。现将2012年6-12月眼科送检的53例疑似真菌性角膜炎患者标本使用墨汁-KOH湿片法镜检、荧光染色法镜检和真菌培养结果进行统计和分析，具体情况报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 53份标本来自2012年6-12月本院眼科就诊的经临床诊断为疑似真菌感染角膜炎的患者。

1.2 标本采集 患者眼部布比可因（贝诺喜）表面麻醉后，在裂隙灯下先用无菌棉签擦去表面坏死组织，再用无菌手术刀片刮取角膜溃疡基底部组织，置于清洁载玻片上，加一滴无菌生理盐水后在其上再加盖一张载玻片，另取一份标本置无菌管中，标本采集后立即送检。

1.3 仪器和试剂 墨汁-KOH消化液为实验室自行配制，墨汁和10%KOH按1：9比例混合。真菌荧光染色试剂为美国Polysciences公司的Fungi-Fluor真菌荧光染色检测试剂盒。真菌培养基为沙保罗斜面，为实验室自行配制。普通光学显微镜和荧光显微镜为日本产奥林巴斯。

1.4 检查方法

1.4.1 墨汁-KOH湿片法镜检 将夹有角膜组织的一张载玻片滴加一滴1：9的墨汁-KOH（10%）混合液，盖上盖玻片压紧后普通光学显微镜镜检。

1.4.2 荧光染色法镜检 夹有角膜组织的另一张载玻片，直接滴加荧光染色液，加盖片2 min后荧光显微镜镜检。

1.4.3 真菌培养 生物安全柜内将无菌管内角膜组织接种于沙氏培养基斜面，25 ℃培养2周。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检查方法染色镜检效果 墨汁-KOH湿片法染色后，在光学显微镜低倍视野下可以观察到角膜坏死组织已经溶解，真菌菌丝及孢子清晰显现。高倍镜下真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）。经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）。

图1 墨汁-KOH湿片法（×400）

图2 荧光染色法（×400）

注：真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）；经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）

2.2 诊断结果比较 53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。以真菌培养为诊断金标准，分析墨汁-KOH湿片法和荧光染色法结果；真菌培养阳性标本中，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%；荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%；两种涂片镜检方法结果差异具有统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。两者染色均为阳性的20例，均为阴性的4例，见表1。

表1 两种涂片镜检方法结果 例

墨汁-KOH 荧光白染色法 合计

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合计 28 4 32

3 讨论

真菌性角膜炎通常是由角膜外伤引起的比较严重的致盲性眼病，病因较多，尤以植物性外伤感染为主[4-5]。此类眼病常可引起患者角膜的溃疡甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的诊断对临床治疗非常重要。尽管典型的临床症状和外伤史有助于诊断，但准确可靠的诊断依然取决于实验室技术[6]。

传统的实验室检查方法，主要以KOH湿片法和真菌培养为主。本室采用的墨汁-KOH湿片法镜检，虽然具有简单、快速、镜下对比度强的优点，但其阳性率较低，且有一定的假阳性存在，从而容易造成漏诊和误诊[7]。真菌培养虽准确可靠，但因培养时间过长（1～2周），故不能做出快速诊断从而影响患者的及时治疗[8]。

随着科学技术发展，一些新的诊断仪器和方法在临床中不断得到应用，并在应用中日臻完善。共焦扫描显微镜是一种新型、无创性角膜影像学检查仪器，它可在活体上对角膜从四维（三维空间和时间）水平进行扫描成像，提供高清晰度的角膜各层结构图像，因而可以从细胞水平对活体角膜的病理生理进行直接观察研究，具有检出率高、快速、安全无创以及可重复等优点，但其对角膜溃疡面积较小或位置较浅的病例易漏诊，且费用较贵[9]。聚合酶链反应（PCR）是引物介导的生物体外特定基因的连续扩增方法，这一技术可以在实验室内完成目的DNA或RNA合成和扩增，如应用临床可以实现病原的早期诊断，但因此方法实验室要求高，试剂价格昂贵而不易推广[10]。

现今，在大多数医院中角膜刮片染色镜检仍是临床应用最为广泛的实验室诊断方法，染色镜检具有取材方便、检测快速及对实验设备要求简单等优点。这些染色方法包括革兰染色、姬姆萨染色、荧光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。此结果，部分原因可能是患者在就诊检查前已经使用抗真菌药物，另一方面，临床症状和外伤史不是真菌性角膜炎确诊的绝对依据，如仅凭临床症状和外伤史诊断，有一定的误诊率。临床32例真菌培养阳性标本，荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%，两者差异具统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。这一结果表明，检测真菌性角膜炎荧光染色法的阳性率明显高于墨汁-KOH湿片法。且荧光染色在荧光显微镜下对比明显容易检出，荧光染色法相对于其他新的检测方法来说费用相对不高，又可以做到对真菌性角膜炎的简单、快速、准确的早期诊断。因此，荧光染色法可以在临床实验室中取代墨汁-KOH湿片法作为真菌性角膜炎早期诊断的首选方法。

参考文献

[1]姚宝珠，陈季生.65例真菌性角膜溃疡临床治疗分析[J].中外医学研究，2011，9（19）：105-106.

[2]高新蕊，苏晶，崔红平.真菌性角膜炎发病机制的研究进展[J].中国医疗前沿，2007，2（21）：38-40.

[3]刘立春.真菌性角膜炎的实验室诊断及药物敏感试验分析[J].中国现代药物应用，2008，2（20）：75.

[4]曾庆延，牛晓光，吴尚操.长江中下游地区真菌性角膜炎发病特征及转归分析[J].国际眼科杂志，2010，10（10）：1947-1949.

[5]马灵军，张丽娟，贺丹，等.吉林省真菌性角膜炎病原学分析[J].中国实验诊断学，2009，13（1）：106-107.

[6]张伟宏，王丽娅，韩雷，等.真菌性角膜炎的早期诊断技术[J].医学与临床（临床决策论坛版），2009，30（6）：65-66.

[7]魏文利，张蕊石，周向京.联合试验在真菌性角膜炎诊断中的应用[J].实用医学杂志，2011，27（1）：113-115.

[8]张进，韩敏杰，骆骏.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].长江大学学报（自然科学版），2010，7（1）：270-273.

[9]王学勇，王绪梅.共聚焦显微镜在真菌性角膜炎中的应用[J].国际眼科杂志，2011，11（2）：311-312.

[10]杨连娟，徐红，温海.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].中国真菌学杂志，2007，2（2）：122-125.

[11]李淼，张林.真菌性角膜炎的研究进展[J].国际眼科杂志，2008，8（2）：384-387.

（收稿日期：2013-06-28） （本文编辑：蔡元元）

1.4.2 荧光染色法镜检 夹有角膜组织的另一张载玻片，直接滴加荧光染色液，加盖片2 min后荧光显微镜镜检。

1.4.3 真菌培养 生物安全柜内将无菌管内角膜组织接种于沙氏培养基斜面，25 ℃培养2周。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检查方法染色镜检效果 墨汁-KOH湿片法染色后，在光学显微镜低倍视野下可以观察到角膜坏死组织已经溶解，真菌菌丝及孢子清晰显现。高倍镜下真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）。经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）。

图1 墨汁-KOH湿片法（×400）

图2 荧光染色法（×400）

注：真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）；经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）

2.2 诊断结果比较 53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。以真菌培养为诊断金标准，分析墨汁-KOH湿片法和荧光染色法结果；真菌培养阳性标本中，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%；荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%；两种涂片镜检方法结果差异具有统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。两者染色均为阳性的20例，均为阴性的4例，见表1。

表1 两种涂片镜检方法结果 例

墨汁-KOH 荧光白染色法 合计

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合计 28 4 32

3 讨论

真菌性角膜炎通常是由角膜外伤引起的比较严重的致盲性眼病，病因较多，尤以植物性外伤感染为主[4-5]。此类眼病常可引起患者角膜的溃疡甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的诊断对临床治疗非常重要。尽管典型的临床症状和外伤史有助于诊断，但准确可靠的诊断依然取决于实验室技术[6]。

传统的实验室检查方法，主要以KOH湿片法和真菌培养为主。本室采用的墨汁-KOH湿片法镜检，虽然具有简单、快速、镜下对比度强的优点，但其阳性率较低，且有一定的假阳性存在，从而容易造成漏诊和误诊[7]。真菌培养虽准确可靠，但因培养时间过长（1～2周），故不能做出快速诊断从而影响患者的及时治疗[8]。

随着科学技术发展，一些新的诊断仪器和方法在临床中不断得到应用，并在应用中日臻完善。共焦扫描显微镜是一种新型、无创性角膜影像学检查仪器，它可在活体上对角膜从四维（三维空间和时间）水平进行扫描成像，提供高清晰度的角膜各层结构图像，因而可以从细胞水平对活体角膜的病理生理进行直接观察研究，具有检出率高、快速、安全无创以及可重复等优点，但其对角膜溃疡面积较小或位置较浅的病例易漏诊，且费用较贵[9]。聚合酶链反应（PCR）是引物介导的生物体外特定基因的连续扩增方法，这一技术可以在实验室内完成目的DNA或RNA合成和扩增，如应用临床可以实现病原的早期诊断，但因此方法实验室要求高，试剂价格昂贵而不易推广[10]。

现今，在大多数医院中角膜刮片染色镜检仍是临床应用最为广泛的实验室诊断方法，染色镜检具有取材方便、检测快速及对实验设备要求简单等优点。这些染色方法包括革兰染色、姬姆萨染色、荧光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。此结果，部分原因可能是患者在就诊检查前已经使用抗真菌药物，另一方面，临床症状和外伤史不是真菌性角膜炎确诊的绝对依据，如仅凭临床症状和外伤史诊断，有一定的误诊率。临床32例真菌培养阳性标本，荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%，两者差异具统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。这一结果表明，检测真菌性角膜炎荧光染色法的阳性率明显高于墨汁-KOH湿片法。且荧光染色在荧光显微镜下对比明显容易检出，荧光染色法相对于其他新的检测方法来说费用相对不高，又可以做到对真菌性角膜炎的简单、快速、准确的早期诊断。因此，荧光染色法可以在临床实验室中取代墨汁-KOH湿片法作为真菌性角膜炎早期诊断的首选方法。

参考文献

[1]姚宝珠，陈季生.65例真菌性角膜溃疡临床治疗分析[J].中外医学研究，2011，9（19）：105-106.

[2]高新蕊，苏晶，崔红平.真菌性角膜炎发病机制的研究进展[J].中国医疗前沿，2007，2（21）：38-40.

[3]刘立春.真菌性角膜炎的实验室诊断及药物敏感试验分析[J].中国现代药物应用，2008，2（20）：75.

[4]曾庆延，牛晓光，吴尚操.长江中下游地区真菌性角膜炎发病特征及转归分析[J].国际眼科杂志，2010，10（10）：1947-1949.

[5]马灵军，张丽娟，贺丹，等.吉林省真菌性角膜炎病原学分析[J].中国实验诊断学，2009，13（1）：106-107.

[6]张伟宏，王丽娅，韩雷，等.真菌性角膜炎的早期诊断技术[J].医学与临床（临床决策论坛版），2009，30（6）：65-66.

[7]魏文利，张蕊石，周向京.联合试验在真菌性角膜炎诊断中的应用[J].实用医学杂志，2011，27（1）：113-115.

[8]张进，韩敏杰，骆骏.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].长江大学学报（自然科学版），2010，7（1）：270-273.

[9]王学勇，王绪梅.共聚焦显微镜在真菌性角膜炎中的应用[J].国际眼科杂志，2011，11（2）：311-312.

[10]杨连娟，徐红，温海.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].中国真菌学杂志，2007，2（2）：122-125.

[11]李淼，张林.真菌性角膜炎的研究进展[J].国际眼科杂志，2008，8（2）：384-387.

（收稿日期：2013-06-28） （本文编辑：蔡元元）

1.4.2 荧光染色法镜检 夹有角膜组织的另一张载玻片，直接滴加荧光染色液，加盖片2 min后荧光显微镜镜检。

1.4.3 真菌培养 生物安全柜内将无菌管内角膜组织接种于沙氏培养基斜面，25 ℃培养2周。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检查方法染色镜检效果 墨汁-KOH湿片法染色后，在光学显微镜低倍视野下可以观察到角膜坏死组织已经溶解，真菌菌丝及孢子清晰显现。高倍镜下真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）。经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）。

图1 墨汁-KOH湿片法（×400）

图2 荧光染色法（×400）

注：真菌菌丝及孢子呈折光反应，与墨汁形成的黑色背景形成反差（图1）；经荧光染色后，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝及孢子呈现绿色，背景为暗红色（图2）

2.2 诊断结果比较 53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。以真菌培养为诊断金标准，分析墨汁-KOH湿片法和荧光染色法结果；真菌培养阳性标本中，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%；荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%；两种涂片镜检方法结果差异具有统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。两者染色均为阳性的20例，均为阴性的4例，见表1。

表1 两种涂片镜检方法结果 例

墨汁-KOH 荧光白染色法 合计

﹢ ﹣

﹢ 20 0 20

﹣ 8 4 12

合计 28 4 32

3 讨论

真菌性角膜炎通常是由角膜外伤引起的比较严重的致盲性眼病，病因较多，尤以植物性外伤感染为主[4-5]。此类眼病常可引起患者角膜的溃疡甚至失明，因此真菌性角膜炎早期的快速而有效的诊断对临床治疗非常重要。尽管典型的临床症状和外伤史有助于诊断，但准确可靠的诊断依然取决于实验室技术[6]。

传统的实验室检查方法，主要以KOH湿片法和真菌培养为主。本室采用的墨汁-KOH湿片法镜检，虽然具有简单、快速、镜下对比度强的优点，但其阳性率较低，且有一定的假阳性存在，从而容易造成漏诊和误诊[7]。真菌培养虽准确可靠，但因培养时间过长（1～2周），故不能做出快速诊断从而影响患者的及时治疗[8]。

随着科学技术发展，一些新的诊断仪器和方法在临床中不断得到应用，并在应用中日臻完善。共焦扫描显微镜是一种新型、无创性角膜影像学检查仪器，它可在活体上对角膜从四维（三维空间和时间）水平进行扫描成像，提供高清晰度的角膜各层结构图像，因而可以从细胞水平对活体角膜的病理生理进行直接观察研究，具有检出率高、快速、安全无创以及可重复等优点，但其对角膜溃疡面积较小或位置较浅的病例易漏诊，且费用较贵[9]。聚合酶链反应（PCR）是引物介导的生物体外特定基因的连续扩增方法，这一技术可以在实验室内完成目的DNA或RNA合成和扩增，如应用临床可以实现病原的早期诊断，但因此方法实验室要求高，试剂价格昂贵而不易推广[10]。

现今，在大多数医院中角膜刮片染色镜检仍是临床应用最为广泛的实验室诊断方法，染色镜检具有取材方便、检测快速及对实验设备要求简单等优点。这些染色方法包括革兰染色、姬姆萨染色、荧光染色以及糖原染色等[11]。

在本研究中，53例疑似真菌感染角膜炎患者送检标本中，32例真菌培养阳性，阳性率为60.4%。此结果，部分原因可能是患者在就诊检查前已经使用抗真菌药物，另一方面，临床症状和外伤史不是真菌性角膜炎确诊的绝对依据，如仅凭临床症状和外伤史诊断，有一定的误诊率。临床32例真菌培养阳性标本，荧光染色法阳性28例，阳性率为87.5%，墨汁-KOH湿片法20例阳性，阳性率为62.5%，两者差异具统计学意义（字2=6.125，P=0.025）。这一结果表明，检测真菌性角膜炎荧光染色法的阳性率明显高于墨汁-KOH湿片法。且荧光染色在荧光显微镜下对比明显容易检出，荧光染色法相对于其他新的检测方法来说费用相对不高，又可以做到对真菌性角膜炎的简单、快速、准确的早期诊断。因此，荧光染色法可以在临床实验室中取代墨汁-KOH湿片法作为真菌性角膜炎早期诊断的首选方法。

参考文献

[1]姚宝珠，陈季生.65例真菌性角膜溃疡临床治疗分析[J].中外医学研究，2011，9（19）：105-106.

[2]高新蕊，苏晶，崔红平.真菌性角膜炎发病机制的研究进展[J].中国医疗前沿，2007，2（21）：38-40.

[3]刘立春.真菌性角膜炎的实验室诊断及药物敏感试验分析[J].中国现代药物应用，2008，2（20）：75.

[4]曾庆延，牛晓光，吴尚操.长江中下游地区真菌性角膜炎发病特征及转归分析[J].国际眼科杂志，2010，10（10）：1947-1949.

[5]马灵军，张丽娟，贺丹，等.吉林省真菌性角膜炎病原学分析[J].中国实验诊断学，2009，13（1）：106-107.

[6]张伟宏，王丽娅，韩雷，等.真菌性角膜炎的早期诊断技术[J].医学与临床（临床决策论坛版），2009，30（6）：65-66.

[7]魏文利，张蕊石，周向京.联合试验在真菌性角膜炎诊断中的应用[J].实用医学杂志，2011，27（1）：113-115.

[8]张进，韩敏杰，骆骏.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].长江大学学报（自然科学版），2010，7（1）：270-273.

[9]王学勇，王绪梅.共聚焦显微镜在真菌性角膜炎中的应用[J].国际眼科杂志，2011，11（2）：311-312.

[10]杨连娟，徐红，温海.真菌性角膜炎的实验室诊断[J].中国真菌学杂志，2007，2（2）：122-125.

[11]李淼，张林.真菌性角膜炎的研究进展[J].国际眼科杂志，2008，8（2）：384-387.

（收稿日期：2013-06-28） （本文编辑：蔡元元）