广西壮族及汉族人群CD40L基因rs1126535C／T 遗传多态性的研究①

陈健明，吴成将，蓝艳，向阳，罗宏成，韦叶生②

（1.右江民族医学院2011级检验本科，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院皮肤科，广西 百色 533000；3.右江民族医学院附属医院检验科，广西 百色 533000）

CD40L是一种Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员，表达于免疫细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、血小板等多种细胞上，参与免疫、炎症、高凝等多种病理生理状态的调控，与其配体CD40 分子相互作用，在肿瘤细胞的抗原呈递、免疫应答反应和细胞的分裂增殖调控等方面发挥着日益重要 作 用［1－3］。编 码CD40L 的 基 因 位 于 染 色 体Xq26 上。CD40L基因存在着基因变异及基因多态性，这种基因的变异和多态性与人类动脉粥样硬化性疾病、X－连锁高IgM 综合征（XHIM）、阿尔茨海默氏病及格雷夫斯病（GD）的联系，已经逐步成为国内外学者研究的热点［4－8］。为此，我们采用DNA序列测定法和单碱基延伸PCR 技术，对CD40L 基因进行多态性研究，对认识遗传因素的发病作用具有重大意义；同时，确定其在正常人群中的分布，将为人类遗传学的研究提供基础性的资料。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取在右江民族医学院附属医院体检健康者，且相互间无血缘关系。广西地区壮族人199例，其中男116例，女83例，年龄25～83 岁；汉族199例，其中男108例，女91例，年龄22～86岁。血常规、空腹血糖及其他生化指标均在参考值范围内，心电图检查正常，排除肾脏、肝脏、内分泌及心脑血管等疾病。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 采集体检健康者静脉血3ml，用乙二胺四乙酸二钾抗凝；采用已建立的PaxGene血液DNA 提取试剂盒［9］进行白细胞的基因组DNA 的提取，在－70 ℃条件下保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成 根据CD40L 基因位点rs1126535C／T 多态性及已知的DNA 序列设计PCR 引物，引物的合成由上海天昊生物科技有限责任公司完成。采用特异性扩增CD40L基因位点rs1126535C／T 碱基的DNA 片段的引物，上游引物序列为：5′－ GGACTGCCCATCAGCATGAAA－3′；下游引物序列为：5′－TCCATCATTTGGGTAGAACCAACCT－3′；延 伸 引 物 序 列 为：5′－TTTTTTTTTTTTACTTTTTGCTGTGTATCTTCATAGAAGG－3′。

1.2.3 PCR 扩增 CD40的PCR 扩增反应体系为20μl，其中含10×PCR 缓冲液2.0μl，0.3mmol／L dNTPs 2.0μl，上、下游引物各1.0μl，模板DNA 1.0μl，TaqDNA 聚合酶1.0u，不足体积用经过两次标准程序高压灭菌的双蒸水补足至20μl。PCR 产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR 获得，PCR产物经虾碱酶（SAP）（from Promega）和外切酶Ⅰ（EXOⅠ）（from Epicentre）纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶（SAP）（from Promega）纯化后在ABI3130XL 上样。单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）分型用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）来分析。

1.3 统计分析 采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，以率来表示计数资料。等位基因和基因型的频率采用基因直接计数法来计算，采用χ2检验或Fisher确切概率法对各组间等位基因和基因型的频率进行对比，以P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD40L基因型检测结果 CD40L 基因rs1126535C／T 多态性，PCR 扩增产物片段大小为190bp。经ABI3130XL 基因检测仪SNP分型结果显示rs1126535C／T 位点检测到CC、CT和TT 三种基因型。经过基因测序后得到的数据进一步证实我们所检测到的结果，见图1。

图1 CD40L基因rs1126535C／T 测序图

2.2 CD40L基因多态性在壮、汉两民族人群中分布频率的比较 计算广西壮、汉两民族健康人群中CD40L等位基因和基因型的频率，采用χ2检验进行计算，CD40L 基因rs1126535C／T位点的等位基因和基因型频率均符合哈迪－温伯格（Hardy－Weinberg）遗传平衡定律，说明我们所选取的研究样本具有群体代表性。其中rs1126535C／T 位点的基因型在广西壮族和广西汉族中均以TT 型最为多见，分别占88.44%和94.47%。其等位基因和基因型频率分布在男女性别之间比较差异无统计学意义（P ＞0.05）；广西壮族及汉族人群中CD40L 基因型频率差异无统计学意义（P ＞0.05），见表1。

2.3 CD40L基因多态性在不同种族人群间的比较 广西汉族人群CD40L基因型和等位基因频率分别与欧洲人、日本人、非洲人比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）；而与北京人及广西壮族人比较基因型频率差异无统计学意义（P ＞0.05），等位基因频率差异有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

表1 广西壮族和汉族人群CD40L基因rs1126535C／T基因型和等位基因分布频率的比较 （n，%）

表2 不同种族及地区人群CD40L基因rs1126535C／T多态性分布频率 （n，%）

3 讨论

生物群体基因多态性现象十分普遍，其中，对人类基因的结构、表达和功能，研究比较深入。基因多态性研究为探索疾病的产生和发展机制以及表型多样化产生的本质开辟了一个全新的领域。在人类基因结构和功能的研究成果日新月异的形势下，对多基因参与的一些常见病，通过候选基因来综合分析疾病的发病机制，从而有效预防疾病发生是未来预防医学一个重要的研究方向，也是目前将人类基因结构性研究成果应用于预防医学的一个较为现实的途径。广西是壮族的聚集地，通过对壮族和汉族两个不同民族CD40L基因多态性的研究，有助于发现基因多态性在不同种族人群中的分布规律，从而为探索一些疾病在不同种族间的遗传规律，提供前瞻性的基础资料。

CD40L又称CD154 即CD40 的配体，属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，与CD40分子相互作用，在肿瘤细胞的抗原呈递、免疫应答反应和细胞的增殖调控方面发挥着重要作用。在上皮细胞、单核细胞、B 细胞、NK 细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等都有CD40L的表达，但主要表达于活化的CD4＋T 细胞和血小板。CD40L与高亲和力的CD40 结合，对T／B 细胞活化和细胞因子的产生起诱导作用，可激活血管内皮细胞表达细胞间黏附分子－1、E选择素上调，吸引血中的白细胞向血管壁聚集［10］。CD40L还能促进Aβ－42诱导的小胶质细胞表面表达CD40和MHCⅡ分子显著增加。促进其向抗原提呈功能的转化，促进适应性免疫应答反应，继而加剧对神经元的损伤［11］，参与多种疾病的发生和发展。了解相关疾病的发病机制与CD40L多态性的关系，将为疾病的预防和临床实践提供理论依据。编码CD40L基因位于X 染色体q26.3－q27.1上，包含5个外显子和4个内含子，其编码蛋白产物含有266 个氨基酸。CD40L基因存在rs1126535C／T 的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），此种基因多态性的存在可能影响着CD40L基因的某些功能，进而影响着同CD40L 有关疾病的产生和进展，因而，对CD40L 基因多态性在不同种族和不同地域人群中分布规律的研究和分析，为持续研究CD40L基因多态性在不同种族人群中同某些疾病的产生以及进展之间的相关性提供了一些分子遗传学的基础性资料。

本文通过采取了单碱基延伸PCR 技术（PCR－SBE）对来自广西壮族自治区的壮族和汉族健康人群CD40L 基因rs1126535C／T 位点多态性的分布情况进行检测，从我们检测的结果可以看出，在壮族人中CC 基因型5.53%、CT 基因型占6.03%、TT 基 因 型 占88.44%；在 汉 族 人 中CC 基 因 型 占1.51%、CT 基因型占4.02%、TT 基因型占94.47%。在广西壮族及汉族人群中CD40L 基因型频率差异无统计学意义（P＞0.05），其等位基因和基因型频率分布在男女性别间比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。我们将来自中国广西壮族自治区的壮族和汉族人同来自欧洲、非洲、日本、北京等人群基因多态性研究结果进行比较和分析后可以看出，在我国广西壮族自治区的健康人群中，我们发现CD40L 基因rs1126535C／T 位点壮族的T 等位基因频率（91.46%）和汉族T 等位基因的频率（96.48%），均 明 显 高 于 欧 洲 人（79.65%），高 于 北 京 人（90.70%），高于非洲人（88.05%），高于日本人（86.63%），其中欧洲人、日本人和非洲人与汉族人比较差异具有统计学意义（P ＜0.05），广西汉族人基因型分布频率同北京人比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），而等位基因分布频率差异具有统计学意义（P ＜0.05）。出现这种情况的原因可能与所处的环境不同，饮食生活习惯等各异所致；从本文统计结果可以明显看出，在不同种族中，CD40L 等位基因的频率和基因型的分布频率存在着明显的差异。

总之，探索我国壮族与汉族人群中CD40L基因多态性的分布及其与相关疾病发病机制的关系，有助于发现基因多态性在不同种族人群中的分布规律，为与CD40L相关疾病的预防及临床实践提供可靠理论依据；同时，确定其在正常人群中的分布，将为人类遗传学的研究提供基础性的资料。

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