HPLC 法测定不同产地竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d

王建科， 李 玮， 林 昶， 陈敏红

(贵阳中医学院，贵州 贵阳550002)

竹叶柴胡为伞形科植物膜缘柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex. Dc. 的干燥根及全草［1］。性苦、辛，微寒，具解表和里、升阳解郁之功效，用于寒热往来，胸满，胁痛，口苦，疟疾，脱肛，中气不足，月经不调等症［2］。分布于陕西、湖北、四川、云南、贵州、湖南等省区，为常用中药柴胡的三大来源之一［3］，西南地区将竹叶柴胡作为柴胡使用［4］，且使用量大。柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用，国内外学者把柴胡皂苷应用于肾病、肝纤维化、肿瘤方面，取得了可喜的成就［5］。竹叶柴胡中含有皂苷(a、d、b2、b4)、柴胡色原酮A，白花前胡丙素，木糖醇等成分［6］。《中国药典》2010 年版收载了柴胡和狭叶柴胡的柴胡皂苷a、d 的定量测定方法［7］，文献报道柴胡皂苷a、d 的测定方法也较多［8-15］，但采用这些方法均未得到竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d 的良好分离，同时有关竹叶柴胡中的柴胡皂苷a、d 的测定方法未见报道。因此，本研究采用高效液相色谱法建立竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d 的定量测定方法，并对不同产地的竹叶柴胡中的柴胡皂苷a、d 进行测定，为建立竹叶柴胡的质量标准提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪(LC-20AT、检测器SPD-20A，日本岛津公司)、Agilent C18色谱柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)、全自动电子天平(AUW220D，苏州岛津公司)、超声波清洗器(HS10260D，天津恒奥公司)、远红外快速干燥箱(YHG-600-S-Ⅱ，上海贺德公司)。

1.2 试剂 氨水、甲醇、无水乙醇为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水。

1.3 对照品 柴胡皂苷a (批号110777-200507)、柴胡皂苷d (批号110778-200506)对照品，均购自中国药品生物制品检定所。

1.4 药材 竹叶柴胡药材购自贵州兴义、四川绵阳、重庆等地，经我院生药教研室魏升华副教授鉴定为伞形科植物膜缘柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. 的干燥根及全草。本次研究的样品均为全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验 Agilent C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-水(B)，进行梯度洗脱(0 ～2 min，70% ～67%B;2 ～10 min，67%B;10 ～30 min，67% ～64%B;30 ～63 min，64% ～60% B);检测波长204 nm;柱温40 ℃;体积流量1.0 mL/min;进样量10 μL。理论塔板数不低于3000。对照品及样品色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷a、d对照品适量，加甲醇溶解，制成含柴胡皂苷a、d分别为0.294、0.182 mg/mL 的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质量的竹叶柴胡样品粉末(过40 目筛)0.5 g，加8%氨水甲醇25 mL，超声提取60 min，过滤，残渣用甲醇20 mL 分2 次洗涤，合并滤液，滤液于60 ℃水浴上挥干，用色谱甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，用0.45 μm 的微孔滤膜滤过，即得。

图1 对照品(A)和供试品(B)的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances (A)and Bupleurum marginatum (B)

2.4 线性关系考察 分别精密吸取柴胡皂苷a、d对 照 品 溶 液 0.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，分别以柴胡皂苷a、d 的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得柴胡皂苷a 线性回归方程为y=453 980.8x+7 307.75，r =0.999 9，表明柴胡皂苷a 的进样量在0.147 ～4.41 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系;得柴胡皂苷d 线性回归方程为y=665 526x-20 788，r =0.999 7，表明柴胡皂苷d 的进样量在0.091 ～2.73 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密称取干燥至恒定质量的贵州兴义产竹叶柴胡炮制样品粉末0.5 g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次。结果柴胡皂苷a、d 峰面积的RSD 分别为2.5%、2.7%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取干燥至恒定质量的贵州兴义产竹叶柴胡炮制样品粉末约0.5 g，精密称定，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h 进行测定，结果柴胡皂苷a、d 峰面积的RSD 分别为2.3%、2.9%，表明供试品溶液于室温下24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取干燥至恒重的贵州兴义产竹叶柴胡炮制样品粉末6 份，每份约0.5 g，精密称定，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果柴胡皂苷a、d 的RSD 分别为2.9%、2.5%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含有量的贵州兴义产竹叶柴胡炮制样品粉末6 份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入柴胡皂苷a、d 对照品适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果见表1。

表1 加样回收率试验测定结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests (n=6)

2.9 样品测定 按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别对10 个不同产地的竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d 进行测定。结果见表2。

表2 样品中柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的测定结果(n=3)Tab.2 Components of saikoside a and saikoside d in Bupleurum marginatum (n=3)

3 讨论

实验分别对甲醇、乙醇、乙腈、5% 氨水-甲醇、7%氨水-甲醇、9%氨水-甲醇进行提取溶剂考察，结果以7%氨水-甲醇提取时皂苷含有量最高，因此在正交试验中，分别选用6%氨水-甲醇、7%氨水-甲醇、8%氨水-甲醇进行实验，由分析可得，3 种提取溶剂没有差异性，因此最终优选出8%氨水-甲醇为最佳提取溶剂。实验对索氏提取法、回流提取法、超声提取法进行提取方法的比较，由单因素考察实验可得出，索氏提取3 h 与超声提取1 h或者回流2 h 效果相同，而且3 种提取方法没有差异性，考虑到提取方法的方便性与实验操作的简单性，因此采用超声提取法进行提取。在正交试验中，考察超声提取时间分别为40、60、80 min，由分析可得，三者之间没有明显的差异性，为了实验的操作方便性，所以采用60 min 为最佳提取时间。由于柴胡皂苷a、d 在提取过程中易受植物体中酚类或酸性成分的影响，致使环氧醚键开环，转化为柴胡皂苷b1及柴胡皂苷b2，因而通常采用弱碱性溶剂提取［16］。

通过对10 个不同产地竹叶柴胡生品中柴胡皂苷a、d 测定可以看出，柴胡皂苷a 的平均含有量为0.12%，柴胡皂苷d 的平均含有量为0.07%，其中云南两个产地竹叶柴胡含有量较高，尤以云南禄丰产的含有量最高，而四川三个产地的竹叶柴胡含有量相对较低，造成含有量差异的原因是否与生长环境、气候、采收季节、加工方法等因素有关，有待进一步研究。

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