SM22α启动子靶向性调控血管平滑肌细胞过表达p27的研究

静亮，彭希，谢敏杰，喻志源，吕家高，王伟

SM22α启动子靶向性调控血管平滑肌细胞过表达p27的研究

静亮a，彭希a，谢敏杰a，喻志源a，吕家高b，王伟a

目的：构建由SM22α特异性启动子介导血管平滑肌细胞（VSMCs）靶向性过表达p27蛋白的慢病毒载体来研究对VSMCs细胞周期的影响。方法：构建重组慢病毒载体（Lenti-SM22α-p27-EGFP），感染原代培养的VSMCs及内皮细胞（VECs）。结果：SM22α-p27慢病毒能对VSMCs表现出高效且精确的抑制作用。SM22α启动子靶向标记的p27能在VSMCs内过表达，且通过G0/G1期阻滞来抑制细胞增殖。结论：由SM22α特异性启动子驱动的重组慢病毒载体能选择性感染VSMCs，有效地引起p27蛋白过表达并产生G0/G1期阻滞。

支架术后再狭窄；药物洗脱支架；重组慢病毒；细胞周期

药物洗脱支架能降低血管狭窄的发生，支架术后再狭窄为常见的并发症[1]。同常规的经皮冠脉介入治疗相比，药物洗脱支架植入后短期再狭窄率能降至10%～30%[2]。然而，诸如紫杉醇或西罗莫司等洗脱药物不仅抑制新生内膜增生，也限制再内皮化的进程，并最终导致晚期支架栓塞的发生[3]。药物洗脱支架并不适用于糖尿病、冠脉畸形等患者[4]。因此，一种针对药物洗脱支架对患者的远期预后并无益处的观点逐渐形成[5]。寻找到一种能双向调控血管平滑肌细胞 （vascular smooth muscle cells，VSMCs）和内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）的药物或许能解决这个问题。

VSMCs能被一系列靶点所标记，如α肌动蛋白、激酶相关蛋白、钙调蛋白结合蛋白、SM22α蛋白[6,7]。其中，SM22α的分子量为22 kDa，于胚胎早期开始在VSMCs内表达。SM22α既往曾被用作VSMCs系的表型标记物[8]，大鼠SM22α有一个高水平转基因表达效率的启动子。SM22α启动子包含5个外显子和4个内含子，总长6 271 bp[9]，曾被广泛用作转基因治疗的靶点。Frutkin等[10]成功通过SM22α启动子驱动转化生长因子 β受体诱导VSMCs内的Cre酶过表达。Clarke等[11]在大鼠动脉粥样硬化模型中构建SM22α启动子-人白喉毒素受体过表达载体。

在经皮冠脉介入术引起的机械性、炎性损伤环境中，VSMCs和VECs的细胞周期通过G0/G1期转换得到激活[12]。然而，目前临床最常用的洗脱药物紫杉醇却通过在G2/M期与微管亚单元结合，从而阻止有丝分裂。与此同时，增殖还受到细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶和细胞周期依赖激酶抑制剂等一系列蛋白共同调控。p27多被认为是一种动脉损伤后VSMCs的内源性调节因子[14]。p27过表达能引起大鼠球囊损伤模型中VSMCs增殖明显抑制[15]。p27敲除的大鼠模型会出现动脉损伤后的内膜增厚[16]。

为了降低晚期支架栓塞和支架术后再狭窄的发生，一种理想化的治疗方式应在损伤局部保持长期高效的药物浓度。为了选择性抑制新生内膜增生而不影响再内皮化，本研究构建重组慢病毒载体Lenti-SM22α-p27-EGFP，它包含特异性启动子、p27和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因；同时还构建仅含有特异性启动子和 EGFP基因的对照病毒Lenti-SM22α-null-EGFP，讨论紫杉醇和重组慢病毒干预后的VSMCs周期差异。

1 材料与方法

1.1 材料

紫杉醇、DAPI购于美国Sigma公司，ViraPower系统购于美国 Invitrogen公司，兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）购于美国Abcam公司，小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）购于中国 Boster公司，Cy3标记的抗兔 IgG、FITC标记的抗鼠IgG购于美国Jackson实验室。流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 SM22α启动子克隆方法 SM22α启动子和GAPDH由PCR方法进行扩增（SM22a上 游 引 物 5'-GCCTTAATTAATTTGCATAGTGCCTGGTTG-3'，下游 引 物 5'-CGCGGATCCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3'，GAPDH上游引物5'-TGCCCACCAGAACATCAT-3'，下游引物5'-TAGCCATATTCGTTGTCGTA-3'）。循环体系：94℃预变性10 min，（94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s）×30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.2 慢病毒载体的构建与准备 SM22α启动子的全套编码序列协同p27（本实验预存）和EGFP基因或单独的EGFP基因（对照病毒）都被整合入慢病毒载体，该病毒通过ViraPower系统在中国上海吉凯公司进行合成。

1.2.3 原代细胞培养 VECs和VSMCs均取材于SD大鼠胸腹主动脉弓。大动脉取材自肾动脉至降主动脉弓，完全剥离外膜，用无菌PBS洗涤。VSMCs：将动脉切成1 mm2大小的碎块，37℃消化2 h（含250 U/mL二型胶原酶的DMEM F12培养基），1 000 rpm离心5 min，弃上清，VSMCs在5%CO2、37℃的培养箱内培养（10%胎牛血清的DMEM高糖培养基）。VECs：轻柔翻转动脉，两端结扎，直接贴附于Ⅰ型鼠尾胶原预包被的培养瓶中，细胞培养于37℃、5%CO2的培养箱中（含20%胎牛血清的M199培养基）。VSMCs和VECs的纯度分别通过SMA和vWF进行检测。后续实验中VSMCs和VECs均以特定密度进行种植，统一24 h后饥饿干预（不含胎牛血清的单纯培养基）12 h后开展实验。

1.2.4 免疫荧光分析 将培养的细胞用无菌PBS清洗3次，冰甲醇固定，37℃固定15 min后，用含0.2%的Triton X-100在37℃破膜15 min，4℃抗体阻断液孵育8 h，在PBS震荡5 min后，孵育一抗：兔抗vWF（1∶400）与小鼠抗α-SMA（1∶200）4℃下孵育8 h，再次用PBS洗涤后，分别加入二抗：Cy3标记的抗兔IgG（1∶1 000），FITC标记的抗鼠IgG（1∶1 000）37℃孵育1 h，继续用DAPI（10 μg/mL）37℃下孵育5 min，用Olympus BX51型荧光显微镜进行观察。

1.2.5 流式细胞分析 4×104/mL VECs和VSMCs种于6 cm培养皿24 h后，将2种病毒 Lenti-SM22α-p27-EGFP（p27组）和Lenti-SM22α-null-EGFP（null组）分别以最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）0、10、50、100分别感染 VECs和VSMCs，并以等量PBS作为对照组。72 h后，胰酶消化细胞，800 rpm离心5 min，弃上清，细胞（10 000）由4℃无菌PBS重悬。细胞通过流式细胞仪统计EGFP阳性细胞数，每组重复3次。1.2.6 Western-Blot分 析 1×105/mL VSMCs种于 10 cm平皿中 24 h后，50 nmol/L紫杉醇和MOI=10的重组慢病毒干预24 h，继续培养至72 h后，无菌PBS清洗，4℃加入RIPA裂解液30 min，12 000rpm离心25 min，将上清混合5×上样缓冲液，110℃水浴变性15 min。罗氏反应试剂盒检测蛋白浓度。Bio-Rad系统电泳与转膜，37℃脱脂奶粉封闭1 h后孵育一抗：鼠抗cyclinB1（1∶ 1 000），鼠抗cyclinA（1∶1000），鼠抗cyclinE（1∶500），兔抗 cyclinD1（1∶500），鼠抗PCNA（1∶500），兔抗p27（1∶2 000），鼠抗p21（1∶200）和兔抗SMA（1∶2 000），二抗均用1∶10 000的辣根过氧化物酶标记的IgG。阳性条带通过ECL发光，X胶片采集后用凝胶成像系统分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较用法，结果以（±sEM）表示，＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SM22α启动子基因克隆

通过预设计的上下游引物，SM22α启动子的编码序列用PCR方法进行检测。外显的DNA序列集中于550 bp（图1）。对阳性克隆进行扩增、测序证实PCR产物含有TATA盒、CArG盒、SP1、YY1和其他重要功能性结构。

图1 大鼠基因组中SM22a启动子的钓取

2.2 培养细胞鉴定

将进行3次传代后的原代培养的VSMCs和VECs种植于盖玻片上并进行免疫荧光染色（图2）。将荧光染色阳性的细胞同DAPI结果进行比对，该原代培养细胞纯度≥90%。

图2 VSMCs(A)和VECs(B)（免疫荧光染色）

2.3 SM22α启动子对VSMCs的选择性感染能力

从72 h起，被感染的VSMCs内出现EGFP表达（图3A）。通过流式细胞仪中慢病毒表现出的高效感染能力（图3B），将MOI=10作为最佳感染指标。在VSMCs中，p27组同对照组相比，EGFP阳性细胞数达（72.39±7.24）%（＜0.05）。null组同对照组相比，EGFP阳性细胞数达（81.45± 8.17）%（＜0.05）。同等MOI下，两种病毒对VSMCs的感染差异并无统计学意义。VECs均无表达EGFP能力。

图3 重组慢病毒对VSMCs和VECs的双向感染能力

2.4 重组慢病毒对VSMCs的细胞周期调控

与对照组和 null组相比，p27组VSMCs的cyclinE1和PCNA受到明显抑制，p27含量升高（＜0.05，图4）。null组中，VSMCs的cyclinD1含量明显降低（＜0.05，图4）。

图4 紫杉醇和慢病毒干预VSMCs细胞周期调控因子的表达

3 讨论

新生内膜增生是支架术后再狭窄的主要病因。目前，大量的研究手段均被用于离体或在体实验以实现新生内膜的抑制[17,18]。但这些研究方法均被证实不适用于临床实验。尽管早期的研究结果表明药物洗脱支架能有效影响再狭窄的形成，当下的实验结果依旧提示使用药物支架再狭窄的发生率为10%～30%，并伴随晚期支架栓塞等并发症。药物洗脱支架在抑制新生内膜的同时也会干预再内皮化的进程。因此，理想化的治疗方案应当具备VSMCs特异性抑制增殖作用，而不影响VECs的理论，得到越来越多的认可[19]。为了证实这种观点，本研究通过VSMCs和VECs研究SM22α的靶向性作用。

尽管药物洗脱支架能诱导VSMCs和VECs的增殖，其细胞周期差异尚不十分明确。然而，相关研究证实G1/S期转换参与支架术后细胞活化进程。p27通过对cyclinE/CDK2复合物活性的抑制调控G1/S期转换，也被认为是一种内源性调节因子。除此之外，p27也被一系列洗脱药物直接作用，如雷帕霉素、西罗莫司和紫杉醇[21-23]。在以上药物中，紫杉醇一直被认为通过G2/M期阻滞产生作用。然而，近年来相关研究证实紫杉醇也能够对G1/S期阻滞产生作用[24]。因此，本研究构建SM22a启动子驱动的过表达p27重组慢病毒来研究VSMCs特异性的G0/G1阻滞是否能够有效抑制增殖。

本研究结果显示重组慢病毒能特异性感染VSMCs，并有效抑制细胞增殖。尽管近年来相关研究开拓了一系列方法来改进药物洗脱支架，其中大部分依然局限在找到一种能够在损伤局部产生新型细胞周期干预途径的药物[25,26]。基因治疗不仅能够靶向性抑制VSMCs增殖，还能在小范围内长期稳定的表达。

本研究中Western-blot结果证实重组慢病毒能靶向性影响 VSMCs到cyclinD1、p27和PCNA的表达。PCNA的表达量说明过表达p27能出现更明显的增殖抑制作用。在血管重塑晚期，p27含量通常受到VECs的影响而上调[28]。这种生理进程往往受到药物的影响而发生紊乱。Lenti-SM22α-p27能避免对内皮的抑制作用，并直接引起VSMCs自表达的p27含量增加，进而更好地抑制再狭窄发生。

综上所述，Lenti-SM22α-P27-EGFP重组慢病毒已在离体实验中被证实能安全高效地通过 G0/G1期阻滞，抑制VSMCs增殖，VECs的修复也未受到影响。重组慢病毒对细胞周期提供更为精确的调控作用，这些特点都为支架术后再狭窄治疗方案的改进提供了新的思路。

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Targeted over-expression p27 by Lenti-SM22alpha-p27-EGFP Recombinant Lentiviral Vectors on Vascular Smooth Muscle Cells

Objective:To construct Lenti-SM22alpha-p27-EGFP recombinant lentiviral vectors targeting vascular smooth muscle cells (VSMCs)and to investigate the impact on VSMCs proliferation by cell cycle analysis. Methods:Recombinant lentiviruses were constructed.The viruses were transfected into VSMCs and vascular endothelial cells(VECs).Results:SM22α-p27 lentiviruses exhibited effective and specific inhibition on VSMCs. SM22α promoter targeted p27 was able to be selectively over-expressed in VSMCs and to inhibit proliferation by cell cycle arrest at G0/G1.Conclusion:Recombinant lentiviruses driven by SM22α promoter could selectively infect VSMCs,thus lead to p27 protein over-expression and G0/G1 arrest.

in-stent restenosis;drug-eluting stents;recombinant lentivirus;cell cycle

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.005

华中科技大学同济医学院附属同济医院 a.神经内科 b.心内科武汉 430030

国家自然科学基金（No.81030021，30870 641）

2014-03-01

王伟wwang@tjh.tjmu.edu. cn