文 彬,陈 然,彭佩纯,邓 鑫
广西中医药大学附属瑞康医院,南宁 530011
肝硬化的形成是一个多因素、多环节、多途径的病理损伤过程。MMP-9 是基质金属蛋白酶(MMPs)家族类重要成员,可以水解沉积的细胞外基质(ECM)。整合素作为跨膜信号分子,介导细胞与细胞外基质黏附,通过激活多种信号分子,导致细胞生物学行为改变[1]。越来越多证据表明细胞外基质的合成、降解功能失衡[2]及整合素介导的细胞外基质-整合素-细胞骨架黏附网络系统可以调控肝星状细胞的增殖与凋亡,在肝纤维化形成中发挥重要作用[3]。天然牛磺酸是名贵中药“牛黄”的有效成分之一,前期的实验研究发现天然牛磺酸具有较好的抗肝纤维化作用[4]。本研究通过荧光定量PCR、免疫蛋白印迹法探讨天然牛磺酸对肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表达的影响,旨在为进一步揭示天然牛磺酸抗肝硬化的作用机制提供依据。
SD 大鼠,SPF 级,6~7 周龄,雄性,体重(170 ±20)g,广西医科大学动物实验中心提供,动物合格证:scxk 桂2009-0002。
天然牛磺酸从乌蛤肉提取,采用热水提取法[5],红外光谱仪鉴定产品质量;四氯化碳(CCl4),分析纯,购于天津富宇精细化工试剂厂产品;食用酒为北京方庄酒厂提供;食用橄榄油(西班牙贝蒂斯);肝纤四项放射免疫分析测定盒(上海海军医学研究所生物技术中心产品);总RNA 提取试剂盒(K0731)、逆转录试剂盒(K1622)、荧光扩增试剂盒(k0222)均由(加拿大Fermentas 公司)提供;鼠抗单克隆Integrin β1 抗体(英国Abcam 公司,货号:ab52971)、鼠抗单克隆MMP9 抗体(英国Abcam 公司,货号:ab76003);HRP 标记的二抗(美国Bio-rad公司,批号:172-1011);PVDF 膜(美国Millipore 公司,批号:IPVH00010);超微量分光光度计(美国Qμawell,Q5000);荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司,ABI Stepone Plus)。
采用复合因素法[6]制备肝硬化大鼠模型,大鼠首次以0.5 mL/100 g 皮下注射(橄榄油60% +40%CCl4)混合液,以后每隔3 日按0.3 mL/100 g 体重皮下注射,每周2 次;15%酒精为唯一饮料,0.5%胆固醇、20%猪油、79.5%玉米面的高脂饲料喂养,满10 周时随机抽取5 只大鼠行肝脏病理学检测;正常组则以普通饲料和纯净水喂养。
75 只SD 大鼠适应性饲养1 周后,随机分为对照组、模型组、天然牛磺酸高、中、低剂量组,每组各15 只。正常对照组不经造模处理,从实验第1 d 开始,给予相同剂量的生理盐水皮下注射;模型组给药方法同模型制备;天然牛磺酸治疗组在造模成功后,按高中低(1.2、0.6、0.3g/kg·d)剂量灌胃,每天一次,连续60 d,直至实验结束;模型组及对照组大鼠给与相同剂量生理盐水灌胃。
血清HA、LN、IV、PCIII 的检测采用放射免疫法,严格按试剂盒步骤操作。
各基因引物序列如下:MMP-9 上游:AAGGTCGCTCGGATGGTTAT,下游:AGTTGCCCCCAGTTACAGTG;Integrin-β1 上 游:TTGCCTTGCTGCTGATTTGG,下游:AGTTGTCACGGCACTCTTGT;GAPDH 上 游:TGACTCTACCCACGGCAAGT,下 游:TACTCAGCACCAGCATCACC。取新鲜肝脏组织,应用TRlzol 法抽提总RNA,超微量分光光度计测定OD260/280 吸光值,计算总RNA 含量及纯度。严格按照逆转录试剂盒(K1622)将RNA 逆转录成cDNA后进行扩增反应。以GAPDH 为内参基因,QPCR 体系配置(20 μL):2 ×Master Mix 10 μL,Forward Primer(10 mM)0.8 μL,Reverse Primer(10 mM)0.8 μL,cDNA 0.8 μL,Water nuclease-free 7.6 μL。QPCR 反应条件:Integrin-β1 反应条件:95 ℃预变性5 min;95℃15s 变性,62 ℃1 min 退火,扩增35个循环;最后72 ℃延伸7 min。MMP-9 反应条件:94 ℃预变性4 min 后,以94 ℃变性40 s,60 ℃退火35 s,共40个循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR 反应结果数据采用2-△△CT进行相对定量比较。
采用免疫蛋白印迹技术,取100 mg 新鲜肝组织加裂解液(50 mmoL/L Tris-HCL pH 7.2,0.15mol/L NaCl,1%NP-40,1%SDS,5 mmoL/L EDTA,1 mmoL/L PMSF)充分裂解,4 ℃,12000 rpm 离心10 min,取上清提取肝组织总蛋白,测定总蛋白浓度。取40 μg 总蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白转移至PVDF 膜上,经5%脱脂奶粉溶液封闭后,分别加入一抗MMP-9(1∶100)、integrin-β1(1∶500),抗体4 ℃孵育过夜,洗涤后以偶联HRP 标记的二抗(1∶5000)结合反应,ECL 显影曝光,GAPDH 为内参,Quantity One 软件半定量分析特异性条带灰度值,与内参灰度值的比值为蛋白相对含量。
应用SPSS 17.0 统计软件进行分析,计量数据用均数±标准差()表示,多组间指标的检测采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
正常对照组大鼠一般情况好,皮毛色泽光滑、柔顺;模型组大鼠精神萎靡,易惊恐烦躁,体重减轻,皮毛色泽无光滑,造模期间死亡4 只,随机抽取的5 只大鼠肝脏病理学检测均提示肝硬化模型制作成功;天然牛磺酸治疗组大鼠皮毛柔顺,体重增加,精神状况明显改善,治疗期间无死亡。
与对照组相比,模型组大鼠血清HA、LN、IV-C和PCIII 水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,天然牛磺酸各剂量组HA、LN、IV-C 和PCIII 均明显降低(P<0.01);中、高剂量组降低HA、LN、IV-C和PCIII 水平明显优于低剂量组(P<0.05),中、高剂量组间比较差异无统计学意义(P >0.05)(见表1)。
表1 各组大鼠血清肝纤维化指标比较()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()
表1 各组大鼠血清肝纤维化指标比较()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()
注:NT 代表天然牛磺酸,与对照组比较,△P<0.01;与模型组比较,★P<0.01;与中剂量组比较,○P >0.05。Note:NT-Natural Taurine,Compare with control,△P<0.01;Compare with Model,★P<0.01;Compare with NT-M,○P >0.05.
图1 GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 扩增和溶解曲线图Fig.1 Amplification and meltcurves of GAPDH,MMP-9,Integrinβ1
提取总RNA 用超微量分光光度计测定OD260/280 吸光值在1.8~2.0 之间,RNA 纯度符合扩增要求。GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 实时荧光定量PCR扩增曲线呈S 型,基线平滑,将检测临界点定在CT值,即PCR 产物进入指数增长期的起始点。产物熔解曲线呈锐利的单一峰,熔解温度(Tm)均一,说明PCR 产物特异性高,无杂带(见图1)。
以相对定量法2-△△CT值[7]比较各组大鼠MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达水平,发现模型组MMP-9、Integrinβ1 mRNA 表达水平明显高于正常对照组;天然牛磺酸低剂量组MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),天然牛磺酸中高剂量组MMP-9、Integrin-β1 mRNA表达降低尤明显,与模型组比较差异非常显著(P<0.01)。(见图2)。
图2 各组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表达水平比较Fig.2 MMP-9,Integrin-β1 mRNA expression level in different groups
各组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 与内参GAPDH 平均灰度值比值分别为:正常组(4.1 ±1.0,2.2 ±0.6),模型组(9.0 ±1.9,5.0 ±1.1),高剂量组(4.4 ±1.1,2.4 ±0.7),中剂量组(4.3 ±1.1,2.4±0.8),低剂量组(6.1 ±1.3,3.6 ±0.9)。与正常组相比,模型组大鼠肝组织MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达明显增加(P<0.01);天然牛磺酸各剂量组可以显著降低模型组MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达,差异均有统计学意义(P<0.01);中剂量组降低MMP-9、Integrin-β1 蛋白表达明显优于低剂量组(P<0.01),与高剂量比较差异无统计学意义(P >0.05)(见图3)。
图3 各组大鼠MMP-9 蛋白(A)、Integrin-β1 蛋白(B)表达水平Fig.3 MMP-9(A)andIntegrin-β1(B)protein expression levels in different groups of rats
肝硬化目前尚缺乏良好的治疗手段,中医中药在此方面具有广阔前景,天然牛磺酸是名贵中药“牛黄”的有效成分之一,也是多种中药的有效成分,海洋生物如乌蛤、珍珠母、牡蛎、海藻等含有丰富的天然牛磺酸,现代药理学研究表明[8,9]:天然牛磺酸具有解毒护肝,抗氧化损伤,抗肿瘤及增强机体免疫功能等活性。我们的前期研究也证实天然牛磺酸可以通过减轻肝细胞炎症反应,降低脂质过氧化而达到抗纤维化的作用[4]。
随着对肝纤维化机制了解的深入,细胞外基质-整合素-细胞骨架调控系统在肝纤维化中的作用越来越受到重视。整合素作为一类黏附分子,主要由α 和β 两条肽链以非共价键连接而形成的异二聚体的跨膜糖蛋白,其配体主要为细胞外基质(ECM)蛋白[10]。目前认为肝星状细胞的激活、凋亡等与细胞外基质、黏附分子的相互作用密切相关[11]。也有报道ECM-整合素-细胞骨架组成的黏着斑已成为肝纤维化进展的关键环节,ECM 可以与整合素通过FAK信号传导来调控肝星状细胞(HSC)的活化增殖与凋亡,进而影响肝纤维化的进程[3]。
基膜性MMPs 主要包括MMP-2 和MMP-9,是调控肝内细胞外基质(ECM)降解的主要酶类,其在肝纤维化中的作用,目前仍存在不同观点,有认为MMP-9 可以破坏肝窦内基底膜,破坏肝细胞内环境,致使肝星状细胞(HSC)活化,促进肝纤维化的形成[12]。也有研究表明增加MMP-9 表达量不仅可以降解过多沉积的间质性胶原纤维,而且抑制HSC 胶原酶表达及减少基质金属蛋白酶抑制因子的产生,对逆转肝纤维化发挥有利作用[13,14]。本实验结果发现模型组大鼠MMP-9 表达量明显增多,至于在肝纤维化进程中起促进或逆转作用,目前机制尚未明确:一方面肝纤维化形成中由于胶原过度沉积,MMP-9 持续升高可能是机体代偿性降解过度沉积的细胞外基质;另一方面MMP-9 持续增多,是否破坏内基底膜及促进HSC 激活,此方面的论据仍有待进一步考证。
Sheu 等研究表明MMP-9、Integrin-β1 存在多种生物体内,并且可以表达于多种正常细胞[15]。本实验中各组大鼠肝内均可见到MMP-9、Integrin-β1 表达,与Sheu 等研究结果一致。但肝硬化大鼠MMP-9、integrin-β1 表达较正常大鼠异常增多,说明MMP-9、Integrin-β1 与肝纤维化密切相关,其在基因和蛋白的高表达与肝硬化呈正相关,两者之间可能通过(细胞外基质-整合素-细胞骨架)的黏附而发挥协同作用。天然牛磺酸可以显著降低MMP-9、Integrinβ1mRNA 及蛋白表达,以中、高剂量组较明显,可见天然牛磺酸抗肝硬化的作用机制可能与调控MMP-9、Integrin-β1 表达水平有关,但天然牛磺酸对MMP-9、Integrin-β1 调控机制及信号传导途径仍未明了,有待进一步深入研究。
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