黄连素联合阿托伐他汀降低脑梗死患者外周血淋巴细胞MIF 和MCP-1 表达的研究

迟丽屹，周 岩，刘养凤，潘 娜，张彦海

(解放军第四五一医院a.神经内科，b.内分泌科，c.干部病房，陕西 西安710054)

不稳定的动脉粥样硬化斑块是发生脑梗死的一个主要危险因素，是脑梗死危险预测的重要指标［1］。阿托伐他汀是常用的治疗动脉粥样硬化的药物，但使用成本较高，因此开发更为低廉而有效的替代药物具有重要意义［2］。黄连素是中药黄连的主要组成成分，在体内具有多种治疗功能［3，4］。淋巴细胞巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是介导多种细胞活动的细胞因子，在多种系统和组织的细胞中都有表达，其中包括活化的T 淋巴细胞、单核/巨噬细胞等［5］。单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)是一种重要的趋化蛋白，常表达于不同类型细胞中如单核细胞、平滑肌细胞、T 淋巴细胞和嗜碱性粒细胞［6］。研究表明，淋巴细胞巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表达对于动脉粥样硬化斑块的形成及稳定性具有重要作用［7］。本研究采用黄连素与阿托伐他汀体外分别处理人体外周血淋巴细胞，观察药物处理对外周血MIF 和MCP-1 表达的影响，同时应用黄连素联合阿托伐他汀治疗颈动脉粥样硬化合并脑梗死患者，观察患者血清MIF 和MCP-1 表达水平变化，为阐明黄连素在机体中具体作用机制及其在临床治疗中的推广应用奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013 年5 ～9 月在解放军451医院神经内科就诊的120 例脑梗死合并高脂血症患者(其中男58 例，女62 例)，均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准［8］。通过计算机随机编码将120 例患者随机分为4 组:对照组30例，其中男14 例，女16 例，年龄(55.9±6.7)岁;阿托伐他汀组30 例，其中男17 例，女13 例，年龄(54.3±4.9)岁;黄连素组30 例，其中男12 例，女18例，年龄(56.1±6.3)岁;联合处理组30 例，其中男15 例，女15 例，年龄(55.6±5.2)岁。4 组患者的年龄、性别、MES 数目和颈动脉粥样硬化性狭窄、血液炎症因子间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究获得本医院伦理委员会的批准，患者或患者家属对研究知情并签署知情同意书。

1.2 试剂及仪器 本研究所用主要试剂:淋巴分离液(宝生物/大连)、DMEM 培养基(Gibco/USA)、L-谷氨酸(Sigma/USA)、ELISA 试剂盒(爱思进/杭州)、RNA-Solve Reagent 试剂盒(Invitrogen/USA)、DyNAmo SYBR ® Green qPCR 试剂盒(宝生物/大连)、CD3-TC、CD4-PE、CD8-FITC 单克隆抗体(Santa Cruze/USA)、兔抗人MIF 和MCP-1 抗体(Abcam/USA)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体(Santa Cruze/USA)、化学发光(ECL)试剂盒(Santa Cruze/USA)、复方黄连素(四川通园制药，国药准字Z51021428)、阿托伐他汀片(辉瑞制药);主要仪器:离心机(Thermo/USA)、细胞培养箱(Sanyo/Japan)、流式细胞仪(Beckman Coulter/USA)、酶标仪(Biorad/USA)、DNA Engine OpticonTM2 荧光检测系统(Eppendorf/USA)、凝胶电泳系统(Bio-rad/USA)

1.3 研究方法

1.3.1 人体血液淋巴细胞的分离 取患者的外周静脉血10 ～15 ml，稀释后加在淋巴细胞分离液液面上，淋巴细胞分离液与稀释后的血液的体积比为l ︰ 1，2 500 r/min(离心半径10 cm)离心20 min。吸取白膜层和淋巴细胞分离液层，3 000 r/min(离心半径10 cm)离心3 ～5 min，弃上清。如此重复洗涤2 次。将细胞重悬于含10%新生牛血清的RPMIl640 培养液中，细胞计数并无菌条件下以1×108/ml 接种于自备的尼龙棉柱内，置37 ℃、5%二氧化碳培养箱内孵育l h，再用含10%新生牛血清的RPMIl640 培养液反复冲洗尼龙棉柱，收集冲洗下的滤液，以1000×g 离心5 min，离心管下的沉淀物即为T 淋巴细胞。分别用CD3-TC、CD4-PE、CD8-FITC 单克隆抗体标记，流式细胞术检测上述CD 分子的表达。

1.3.2 淋巴细胞分组培养与处理 分离获得的淋巴细胞进行计数，并调整细胞浓度至1.0×106/ml，接种于24 孔细胞培养板中，细胞培养使用含100 ml/L 胎牛血清的DMEM 培养基，并加入100 U/ml的青霉素、100 mg/ml 链霉素，以及2 mmol/L 的L-谷氨酸，每间隔l d 进行半量换液。培养48 h 后，将细胞分为4 组:对照组细胞于细胞培养孔中加入100 μl 的溶媒;阿托伐他汀组于细胞培养孔中加入10 μmol/L 阿托伐他汀进行处理;黄连素组于细胞培养孔中加入10 μmol/L 黄连素;联合处理组:于细胞培养孔中加入10 μmol/L 黄连素联合10 μmol/L阿托伐他汀进行处理。细胞处理4 h 后换液培养。培养4 h 后利用qRT-PCR 法检测细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 的表达。

1.3.3 治疗方法 对照组患者接受常规治疗，即口服肠溶阿司匹林100 mg/d;阿托伐他汀组患者在常规治疗的基础上口服阿托伐他汀片40 mg/d;黄连素组患者在常规治疗的基础上口服黄连素400 mg/d;阿托伐他汀联合黄连素组患者在常规治疗基础上口服阿托伐他汀片40 mg/d 和黄连素400 mg/d。所有患者共治疗4 周。

1.3.4 血清MIF 和MCP-1 的水平测定 分别抽取4 组患者的清晨空腹时肘静脉血5 ml，采用ELISA法检测患者的血清MIF 和MCP-1 的水平，根据说明书严格按步骤进行操作，每个结果重复3 次。所有患者于开始治疗后第4 周用同样的方法复查上述指标。

1.3.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测患者外周血淋巴细胞MIF 和MCP-1 的mRNA 表达 利用RNA-Solve Reagent 试剂盒提取血液淋巴细胞总RNA，反转录合成cDNA。利用cDNA 进行MIF 和MCP-1 基因片段扩增，扩增所用引物如表1 所示。用10×buffer 2.5 μl、dNTPs 2 μl、上下游引物(20 μmol/L)分别为0.5 μl(每个片断均单独扩增)、Ex Taq 酶0.2 μl、cDNA 2 μl、灭菌三蒸水17.3 μl 配制25 μl 反应体系。扩增反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共36 个循环;72 ℃延伸8 min。扩增产物电泳后染色、观察。将PCR 产物纯化、测序，序列分析和比较采用DNAMAN 分析软件。0.5 μl 20 pmoL 引物，2 μl cDNA 模板(＜10 ng/μl)。反应条件为:UNG 酶50 ℃孵育2 min，94 ℃预变性10 min。94 ℃DNA 变性20 s，引物在50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，72 ℃后延伸10 min。融解曲线的制作条件为65 ～95 ℃，每0.2 ℃停留1 s。目的基因(MIF 和MCP-1)和β-actin 基因的拷贝数分别根据产生的Ct值从各自的标准曲线获得。取3 次重复的平均值，用MIF、MCP-1 基因的拷贝数除以β-actin 的拷贝数作为靶基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR 扩增基因引物序列

1.3.6 Western blot 检测外周血淋巴细胞MIF 和MCP-1 蛋白表达 提取淋巴细胞中的总蛋白，测定蛋白的浓度，取蛋白样品30 μg，首先进行SDSPAGE。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并用10 g/L 丽春红染色检测转移效果。而后，将膜放在10 ml 20 g/L 脱脂奶粉中封闭1 h;加入一抗兔抗人MIF 和MCP-1 抗体(1 ∶1000)，4℃过夜孵育;加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1 ∶1000)室温孵育2 h;暗处发光。化学发光(ECL)，在暗盒中覆盖X 光胶片曝光。胶片拍照，用凝胶图像分析系统分析，比较MIF、MCP-1 与β-actin 条带的相对积分光密度(OD)值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0 统计软件和Excel 软件对实验数据进行分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析和两两比较(LSD 法)。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外处理外周血淋巴细胞MIF 和MCP-1 mRNA 的表达 分离脑梗死患者外周血T 淋巴细胞，经流式细胞术检测CD3、CD4 和CD8 阳性率分别为74.3%、54.9%和52.3%(图1)。在淋巴细胞中分别添加阿托伐他汀、黄连素或黄连素联合阿托伐他汀进行处理，培养4 h 后qRT-PCR 法检测，结果显示:联合处理组淋巴细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 的表达水平明显低于对照组、阿托伐他汀组和黄连素组(P＜0.05)，见图2。

图1 外周血淋巴细胞的鉴定

图2 4 组淋巴细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 表达的比较* 与联合处理组比较，P ＜0.05

2.2 体外处理外周血淋巴细胞MIF 和MCP-1 蛋白的表达 免疫印迹法检测阿托伐他汀、黄连素或黄连素联合阿托伐他汀处理后的外周血淋巴细胞中MIF 和MCP-1 蛋白的表达结果显示:联合处理组细胞中MIF 和MCP-1 蛋白水平明显低于对照组、阿托伐他汀组和黄连素组(P＜0.05)，见图3。

图3 4 组淋巴细胞中MIF 和MCP-1 蛋白表达的比较* 与联合处理组比较，P ＜0.05

2.3 临床分组治疗患者血清中MIF 和MCP-1 蛋白水平 ELISA 检测临床分组治疗患者血清中MIF和MCP-1 蛋白水平结果显示:联合治疗组患者血清中MIF 和MCP-1 蛋白水平明显低于对照组、阿托伐他汀组和黄连素组(P＜0.05)，见图4。

图4 临床分组治疗患者血清中MIF 和MCP-1 蛋白表达的比较* 与联合处理组比较，P ＜0.05

2.4 临床分组治疗患者体内淋巴细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 表达qRT-PCR 法检测分组治疗患者淋巴细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 的表达水平结果显示:联合治疗组患者血清中MIF 和MCP-1 蛋白水平明显低于对照组、阿托伐他汀组和黄连素组(P＜0.05)，见图5。

图5 临床分组治疗患者淋巴细胞中MIF 和MCP-1 mRNA 表达的比较 * 与联合处理组比较，P ＜0.05

3 讨论

脑梗死发生的一个主要病因是颅内外动脉粥样硬化斑块形成和脱落，而外周血淋巴细胞对动脉粥样硬化斑块的形成及其稳定性具有重要影响［9］。本研究首先分离并检测了脑梗死患者外周血淋巴细胞，其CD3、CD4 和CD8 阳性率达到了74.3%、54.9%和52.3%，反映了其中占据大部分的为T 淋巴细胞。利用分离的淋巴细胞，体外添加10 μmol/L 的阿托伐他汀或10 μmol/L 黄连素处理后均显著降低了淋巴细胞中MIF mRNA 及蛋白的表达，而联合处理则使得MIF 的表达比单独处理显著更低。同时淋巴细胞中MCP-1 的表达也受到了阿托伐他汀、黄连素或两者联合处理的抑制作用。在细胞中，阿托伐他汀能够抑制细胞内参与炎症反应的转录因子-核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)，从而抑制下游编码炎症因子基因如MIF、MCP-1、IL-1 和TNFα 的转录［10，11］。黄连素作为一种具有抗炎作用的中药提取物，常用于各种慢性疾病的治疗。研究显示黄连素能够抑制细胞中NF-κB 信号途径，并减轻由动脉粥样硬化性肾血管疾病导致的慢性肾脏损伤［12］。然而，阿托伐他汀与黄连素对细胞内NF-κB信号途径的影响是否通过相同的作用机制目前还不清楚。本研究验证了黄连素与阿托伐他汀能够直接作用于淋巴细胞，抑制细胞因子MIF 和MCP-1 的表达。

本研究将脑梗死患者随机分组接受4 种不同的治疗方法，结果显示出阿托伐他汀和黄连素能在患者体内降低血清MIF 及MCP-1 的水平以及二者在淋巴细胞中的表达。许多研究证据表明在动脉粥样硬化致病机制中，淋巴细胞MIF 及MCP-1 的表达和分泌还受到体内氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)、高胆固醇血症、巨噬细胞分泌的TNF-α、细胞黏附分子和P 选择素等因素的影响［13］。在体内，阿托伐他汀可作为3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶的抑制剂，可以阻断胆固醇合成而降低患者体内LDL-C 水平，从而能通过减少淋巴细胞外刺激因素来降低患者血清中MIF 和MCP-1［14］。方永祥等利用阿托伐他汀治疗急性冠脉综合征患者，治疗2 周后阿托伐他汀组患者血清中MIF、MMP-9 及hs-CRP 水平显著降低，并且与对照组相比也具有显著差异［15］。研究也证明黄连素能够调节患者血脂水平，并且抑制T 细胞的活化，显著降低T 细胞早期活化抗原CD69 和中期活化抗原CD25 的表达，从而减少活化的T 细胞合成分泌MIF 和MCP-1［16］。本研究中阿托伐他汀与黄连素一方面直接抑制淋巴细胞内信号传导，另一方面在体内改善血脂代谢减少刺激T 细胞活化的因素，从而减少细胞因子MIF 和MCP-1 的表达。

综上所述，本研究发现黄连素与阿托伐他汀联合处理能够明显抑制细胞MIF 和MCP-1 的表达，其抑制效果强于单独处理，同时在患者体内，联合用药也导致了MIF 和MCP-1 的表达受到显著抑制。降低患者体内炎症水平，调节免疫功能是治疗脑梗死合并动脉粥样硬化患者的重要途径，因此本研究为脑梗死治疗提供理论依据。然而，还需更多的实验来阐明黄连素联合阿托伐他汀调节体内免疫的作用机制。

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