浸润性尿路膀胱上皮癌中人类表皮生长因子受体-2表达与扩增的研究*

秦海明 金 庆 程 琳 宋福林 崔 彤

人类表皮生长因子受体-2（HER2）受内源性酪氨酸激酶调控，控制生理性细胞增殖。对于HER2基因扩增状态可评价乳腺癌的预后以及预测靶向治疗的反应［1-4］。在乳腺癌中，HER2基因的扩增达到20.8%［2］，并且与HER2蛋白表达有良好的相关性。

研究显示，在浸润性膀胱癌（UBC）中也可以出现HER2的扩增和/或过表达。然而，不同研究显示的数据出现较大差距，过表达从23%～80%，扩增从0～32%不等［5-7］。也有研究显示，膀胱癌与HER2基因状态无关，而与17号染色体多倍体状态有关［8］。因为国内分子病理水平相对滞后，大多临床数据均采用国外资料，但随着研究的深入，不同基因在不同人种间可以出现较大差异。例如肺腺癌患者EGFR突变率亚洲和非亚洲患者分别为61%和25%［9］。HER2基因在膀胱癌中作用机制的研究相对较少，本实验分析不同分期的UBC中HER2蛋白表达和基因扩增状态，探讨膀胱癌中抗HER2靶向药物应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本选择 沈阳军医总医院2012年5月至2013年6月，诊断为UBC的患者49例，平均年龄68.80岁，其中男性38例，平均年龄66.55岁，女性11例，平均年龄69.91岁。诊断为T2期24例，T3期17例，T4期8例

1.1.2 试剂 HER2抗体：Roche诊断公司，VENTANA anti-HER2/neu（4B5）Rabbit Monoclonal Primary Antibady，批号：C10711。评分采用强度和染色百分比进行半定量评分0～3+。仅对具有浸润性成分进行分析。HER2探针：Abbott Molecular Inc公司，PATH VYSION乳腺癌HER-2基因检测试剂盒（FISH法）（02J01-030），批号439387。预处理试剂Vysis Paraffin Pretreatment Reagent KitⅡ，批号：439970。

1.1.3 仪器 Roche BenchMark XT全自动免疫组织化学染色仪，ThermoBrite AtatSpin原位杂交仪，OLYMPUS BX51荧光显微镜，QIMAGING MicroPublisher 5.0 RTV数码摄像头。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，放入Roche BenchMark XT全自动免疫组织化学染色仪，按设定程序染色，修复温度95℃8 min，100℃4 min，Primary Antiboby 20 min，2抗HRP UNIV MULT 8 min，显色DAB+H2O28 min。程序结束后取出，封片，阳性判定标准按照乳腺癌标准。

1.2.2 FISH染色 切片脱蜡至水，风干；置80℃预处理液中20 min，超纯水3 min；置于蛋白酶溶液中37℃ 15 min，超纯水3 min，风干；70%乙醇1 min，85%乙醇1 min，100%乙醇1 min，风干；加10 μL的Path Vysion探针混合液至杂交区，迅速盖上盖玻片，封胶；83℃表性5 min，37℃杂交过夜；挪去树胶，放入室温的杂交后洗液（2×SSC/0.3%NP-40）浸泡，除去盖玻片；将切片放入73±1℃装有杂交后洗液的Coplin染色缸中，轻轻晃动1～3 s，漂洗2 min；在暗处风干，加入10 μL DAPI复染15 min，暗处避光保存，用荧光显微镜观察。

1.3 统计学方法

利用SPSS 10.0统计软件包进行数据分析，应用t检验和χ2检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分期与性别比较

49例UBC患者以男性居多，其中男性38例，女性11例，差异明显。分期与性别分布见表1。

2.2 HER2蛋白表达及FISH检测HER2基因

UBC分期患者HER2蛋白过表达（2+或3+）的占53.06%，其中2+占28.57%，3+占24.49%。其中T4的100.00%过表达，T364.71%过表达，T2有29.17%过表达，各分期之间表达强度有明显差异性（P＜0.01，图1）。

FISH检测结果显示，49例样本均未出现HER2基因扩增，但有12例患者出现了17号染色体多倍体的情况，但各分期间无显著性差异（P＞0.05，图2）。

表1 HER2蛋白表达免疫组织化学染色结果及FISH检测HER2基因扩增情况Table1 Results of Her2 protein by immunohistochemical staining and gene amplification by FISH

图1 UBC患者HER2免疫组织化学染色结果 （DAB×200）Figure1 HER2 immunohistochemical staining results in UBC patients（DAB×200）

图2 UBC患者HER2基因扩增检测结果 （FISH×1000）Figure2 Results of Her2 gene amplification(FISH method)in UBC patients（FISH×1 000）

3 讨论

患膀胱癌的性别差异是显而易见的，男性患者明显高于女性患者。传统观点认为，这一现象与吸烟及工业化学物质接触有关。有研究显示，膀胱癌的发生与雄激素受体信号通路有关。

在多种癌症中HER2蛋白过表达及HER2基因扩增是重要的影响预后的因素，特别是在导管内乳腺癌，其与预后不良高度相关。重组人源化单克隆抗体—曲妥珠单抗的出现，对乳腺癌的治疗产生了巨大的影响［10］。乳腺癌中大约有20.08%的患者出现HER2基因扩增。但是，IHC和FISH均不能反应总的HER2蛋白水平，或许进一步检测活化/磷酸化HER2可以获得与检测总HER2蛋白量同样的效果，使更多的患者受益［11］。在UBC中检测到HER2的蛋白质过表达或基因扩增，但检测数据显示了较大的差异，有23%～80%的蛋白质过表达，0～32%的基因扩增，且数据大多来自国外。应该积累国内的有效数据，为患者提供有效的治疗方法，而不是单纯地追求新的药物应用。关于HER2蛋白在膀胱癌中的作用研究仍是不很多。但可以发现HER2蛋白在膀胱癌中有一定量的过表达。

研究显示，用罗氏4B5 HER2抗体检测的膀胱癌中，HER2蛋白显示较强的过表达，其中T4期，100%显示2+～3+，即使T2期中2+～3+也达到29.17%，过表达状况显著。并且阳性强度与浸润性相关。在实际使用中，罗氏4B5HER2抗体较其它公司的抗体确实存在染色过强的现象。对于膀胱癌的染色尚需要进一步的改进。

然而，经FISH检测HER2基因均未出现扩增的状况，但出现一定程度的17号染色体多倍体的情况。以前的研究也显示，即使在高分期膀胱癌中HER2基因扩增也较少见，并且与HER2蛋白的表达无相关性［13］，这与乳腺癌差别较大有关。此外，HER2的过度表达并没有相关的基因扩增，说明其它的转录和后转录机制参与并调节了蛋白的表达。或许HER2基因的突变会比基因扩增产生更大的影响［12］。

另外，实验发现17号染色体倍数与膀胱癌分期有相关性，17号染色体多倍体发生膀胱癌的分期高，并易出现浸润性［14］。也有研究显示，17号染色体多倍体患者的预后较差［15］。17号染色体的多倍体可以通过结合形态学，更好的预测膀胱癌的侵袭倾向。

1 Starczynski J,Atkey N,Connelly Y,et al.HER2 Gene Amplification in Breast Cancer:A Rogues'Gallery of Challenging Diagnostic Cases:UKNEQAS Interpretation Guidelines and Research Recommendations[J].Am J Clin Pathol,2012,137(4):595-605.

2 Maria V D,Elena B,Stefania B,et al.Predictors of human epidermal growth factor receptor 2 fluorescence in-situ hybridisation amplification in immunohistochemistry score 2+infiltrating breast cancer:a single institution analysis[J].J Clin Pathol,2012,65(6):503-506.

3 Jinno H,Sato T,Hayashida T,et al.Mechanisms behind trastuzumab resistance as neoadjuvant therapy inHER2-positive operable breast cancer[J].Cancer Res,2012,72:P3-06-22.

4 Kei Aoyama,Takako Kamio,Toshio Nishikawa,et al.A Comparison of HER2/neu Gene Amplification and Its Protein Overexpression Between Primary Breast Cancer and Metastatic Lymph Nodes[J].Jpn J Clin Oncol,2010,40(7):613-619.

5 Matsubara H,Yamada Y,Naruse K,et al.Potential for HER-2/neu molecular targeted therapy for invasive bladder carcinoma:comparative study of immunohistochemistry and fl uorescent in situ hybridization[J].Oncol Rep,2008,19(1):57-63.

6 Sven G,Stefan K,Oliver WH,et al.Different HER2 Protein Expression Profiles Aid in the Histologic Differential Diagnosis Between Urothelial Carcinoma In Situ(CIS)and Non-CIS Conditions(Dysplasia and Reactive Atypia)of the UrinaryBladder Mucosa[J].Am J Clin Pathol,2011,136(6):881-888.

7 Latif Z,Watters AD,Dunn I,et al.HER2/neu overexpression in the development of muscle-invasive transitional cell carcinoma of the bladder[J].Br J Cancer,2003,89(7):1305-1309.

8 Simonetti S,Russo R,Ciancia G,et al.Role of Polysomy 17 in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder:Immunohistochemical Study of HER2/neu Expression and FISH Analysis of c-erbB-2 Gene and Chromosome 17[J].Int J Surg Pathol,2009,17(3):198-205.

9 Girard N,Sima SC,Jackman DM,et al.Nomogram to predict the presence of EGFR activating mutation in lung Adenocarcinoma.Eur Respir J,2012,39(2):366-372.

10 Smith I,Procter M,Gelber RD et al.2-year follow-up of trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer:a randomised controlled trial[J].Lancet,2007,369(2):29-36.

11 Julia D W,Daniela B,Claudia W,et al.Molecular Analysis of HER2 Signaling in Human Breast Cancer by Functional Protein Pathway Activation Mapping[J].Clin Cancer Res,2012,18:6426-6435.

12 Caner V,Turk NS,Duzcan F,et al.No strong association between IHC protein overexpression and gene amplification in high-grade invasive urothelial carcinomas[J].Pathol Oncol Res,2008,14(3):261-266.

13 Ross JS,Wang K,Gay LM,et al.A High Frequency of Activating Extracellular Domain ERBB2(HER2)Mutation in Micropapillary Urothelial Carcinoma[J].Clin Cancer Res,2014,20(1):68-75.

14 Lae M,Couturier J,Oudard S,et al.Assessing HER2 gene amplif i cation as a potential target for therapy in invasive urothelial bladder cancer with a standardized methodology:results in 1005 patients[J].Ann Oncol,2010,21(4):815-819.

15 Sven Gunia,Stefan Koch,Oliver W,et al.Different HER2 Protein Expression Profiles Aid in the Histologic Differential Diagnosis Between Urothelial Carcinoma In Situ(CIS)and Non-CIS Conditions(Dysplasia and Reactive Atypia)of the Urinary Bladder Mucosa[J].Am J Clin Pathol,2011,136(6):881-888.