氢生理盐水对大鼠缺血再灌注肝细胞线粒体功能的保护作用

李宝山 刘 渠 李 强

线粒体是氧化反应的主要场所，也是介导细胞凋亡的发源地。氧化呼吸链在线粒体中产生了大量的氧自由基，一旦体内的氧化还原平衡被打破，线粒体产生的氧自由基便会首先损伤线粒体内膜，导致线粒体渗透性的增加及各种效应因子的释放，进而引起肝细胞的凋亡及坏死［1］。缺血再灌注（ischemia/reperfusion I/R）时，氧自由基在肝细胞内大量聚积，氧自由基对肝细胞内的线粒体结构和功能有明显损害作用，线粒体也是缺血再灌注肝细胞内最先损伤的细胞器［2-3］。

介于氢分子小且呈电中性，很容易扩散，能轻易地穿过细胞膜及细胞器膜到达线粒体产生抗氧化效应［4］，而且本研究已经证实氢生理盐水（hydrogen-rich saline，HS）对缺血再灌注肝功能损伤有着明确的保护作用，旨在进一步研究HS对缺血再灌注大鼠肝细胞线粒体功能及氧化损伤保护作用，为肝脏手术中不可避免的缺血再灌注手术提供一种有效的辅助治疗手段，也可为HS的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理

实验动物采用S-D大鼠（由天津医科大学动物中心提供），体重220～250 g，随机分为3组，每组14只。假手术组：大鼠称重，戊巴比妥（50 mg/Kg）腹腔注射麻醉后，取上腹正中切口开腹，暴露第一肝门，不结扎，分两层缝合腹壁。术后予以生理盐水（5 mL/Kg）腹腔注射；对照组：手术步骤基本同1组，暴露肝脏左、中叶肝蒂。用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，关腹，生理盐水（5 mL/kg）腹腔注射，90 min后去除血管夹，恢复肝血流180 min，建立肝脏I/R损伤的动物模型；HS治疗组：动物模型同2组，予以HS（5 mL/kg）腹腔注射。

所有动物均在清洁级动物房饲养，再灌注180 min后处死。迅速下腔静脉取血，并切取肝左叶。肝脏用冷生理盐水冲洗后，一部分新鲜肝组织采用差速离心法获取肝细胞线粒体，存于-80℃待测MDA、GSH及GSSH；一部分快速切取1 mm3样品块，浸入2.5%戊二醛溶液中待电镜分析。

1.2 主要试剂

HS的制备方法［5-6］：将氢气高压（0.4 MPa）溶于生理盐水6h以达到饱和浓度。饱和HS 4℃保存，并用伽马射线灭菌。用气相色谱法［7］检测HS中氢浓度为0.86 mmol/L，达到了0.6 mmol/L的有效氢治疗浓度［8］。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒和氧化型谷胱甘肽（GSSH）检测试剂盒购自南京建成生物工程所；线粒体抽提试剂盒购自美国Pierce公司；线粒体呼吸功能检测试剂盒购自美国Genmed公司；ATP生物荧光试剂盒购自加拿大Sigma公司。

1.3 主要仪器

Synergy 2分光光度计（BioTek，美国）；WellscanMK 3酶标仪（Thermo，芬兰）；H-7650分析型透射电镜（Hitachi，日本）。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 线粒体形态学观察 取2.5%戊二醛固定的标本，醋酸铀染色，超薄切片干燥后，透射电镜下观察线粒体形态学变化。

1.4.2 线粒体MDA、GSH/GSSH检测 取适量肝细胞线粒体，加入预冷的匀浆介质（pH7.4，0.01 mol/L Tris-HCL，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01蔗糖，0.8%氯化钠溶液）制成线粒体匀浆，按说明书步骤用分光光度计检测样本在532 nm和412 nm波长处的吸光度变化，并按标准曲线计算出线粒体MDA、GSH/GSSH的浓度。

1.4.3 线粒体功能检测 本实验采用线粒体呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、磷氧比（ADP/O）以及肝组织ATP含量作为线粒体功能指标。采用Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能以及Sigma ATP生物荧光试剂盒测定肝组织内ATP含量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 线粒体形态学改变

透射电镜可以看出缺血再灌注大鼠肝细胞线粒体形状不规则、肿胀明显，而且线粒体嵴紊乱、短小，基质凝聚。HS处理组的大鼠肝细胞线粒体大小、形态较一致，线粒体嵴较规则，线粒体嵴膜及基质结构较清晰（图1）。

图1 透射电镜观察I/R后两组大鼠肝细胞线粒体的变化情况（A、B×12 000；C、D×16 000）Figure1 Transmission electron microscopy analysis of the mitochondrial microstructure in rats of two groups after I/R

2.2 肝脏线粒体氧化应激水平变化

MDA是脂质氧化的标记物，缺血再灌注后，大鼠肝细胞线粒体MDA水平显著升高，而HS具有选择性抗氧化性质，能有效抑制肝细胞线粒体MDA生成（P＜0.01，图2A）。GSH/GSSH能有效反应组织的抗氧化能力。与假手术组相比，对照组大鼠肝细胞线粒体GSH明显降低，GSSH明显增高，而5 ml/kgHS能将有效降低GSSH含量，提高线粒体内GSH水平，显著减轻肝细胞线粒体氧化损伤，并提高线粒体抗氧化能力（P＜0.01；图2B、C）。

2.3 肝细胞线粒体功能变化

线粒体功能主要体现在ATP的合成和呼吸功能，缺血再灌注后大鼠肝细胞ATP合成明显减少，线粒体呼吸控制率及磷氧比显著降低，而HS能有效降低线粒体ATP消耗，提高线粒体呼吸控制率及磷氧比，从而增强线粒体呼吸功能（P＜0.01、图3、表1）。

图2 各组大鼠肝细胞线粒体氧化指标变化情况Figure2 Levels of mitochondrial MDA，GSH，and GSSH

表1 HS能显著提高线粒体呼吸控制率及磷氧比，改善线粒体呼吸功能 （n=14）Table1 HS increased the RCR and ADP/D ratio and protected mitochondrial respiratory function（n=14）

图3 各组大鼠肝细胞线粒体ATP消耗情况Figure3 Depletion of mitochondrial ATP in rat hepatocytes

3 讨论

肝脏缺血再灌注是肝胆外科的常见病理过程，各种原因引起的休克、肝脏肿瘤手术时肝门阻断和肝移植等均可引起缺血再灌注损伤。其可导致肝脏急性损伤，使患者术后并发症发生率和死亡率大大提高，从而延长患者住院周期，增加治疗费用。因而有效地保护和改善缺血再灌注患者肝功能，在治疗中具有重要的意义。

研究发现缺血再灌注损伤的机制可能与氧自由基（ROS）、炎性损伤、钙超载、细胞凋亡等多种因素有关。缺血可以使氧自由基在体内堆积，并使内源性抗氧化剂不断消耗，血液灌注恢复后缺血组织正反馈产生大量氧自由基，并激发中性粒细胞浸润，损伤血管内皮细胞，从而激发进一步的炎性级联反应，从而加重组织损伤。缺血再灌注产生的ROS能够直接作用于线粒体，造成线粒体损伤，并通过正反馈效应进一步促进ROS的产生［8-10］，进而引起线粒体和肝细胞的氧化损伤。线粒体主要通过氧化呼吸链产生ATP，为细胞的生化反应及生命活动提供能量，其功能主要体现在呼吸功能及ATP生成，因此线粒体功能也是决定肝细胞功能的重要因素［9，11］。线粒体氧化还原状态的失衡能直接影响线粒体膜结构，进而抑制线粒体呼吸功能的正常运行及ATP的产生。

MDA是氧化损伤的终产物，也是脂质过氧化的标志，可以影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶的活性。GSH是组成机体抗氧化系统的主要成分，既是清除过氧化氢的谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转移酶的底物，也是羟自由基和过氧阴离子的清除剂，在减轻氧自由基损伤、维持细胞蛋白质结构功能和抑制细胞凋亡等方面起着重要作用。GSH可以提供H+来中和氧自由基，其本身在GPx作用下被氧化成GSSH，后者通过NADPH，在谷胱甘肽还原酶作用下还原成GSH。在生理条件下GSH和GSSH形成动态平衡，维护着细胞氧化内环境的稳定，因此检测GSH和GSSG的变化可反映组织氧化还原状态的改变。本研究中，我们直接检测肝细胞线粒体氧化指标，结果表明缺血再灌注大鼠肝细胞线粒体氧化损伤明显，抗氧化能力明显降低。进一步研究发现缺血再灌注后的大鼠肝细胞的线粒体结构和功能出现了明显损害，主要表现为RCR、磷氧比及肝组织ATP含量下降，线粒体超微结构明显受损。

腹腔注射HS后，肝细胞线粒体较对照组MDA和GSSH的产生减少，GSH水平明显提高，这表明HS能显著减轻线粒体的氧化应激，提高线粒体抗氧化能力。HS还能显著降低线粒体ATP消耗，抑制线粒体呼吸控制率及磷氧比的降低，从而改善线粒体功能。HS处理后电镜显示线粒体嵴更加规则，线粒体嵴膜及基质结构较对照组清晰，能有效维护线粒体的形态结构。

总之，本研究显示腹腔注射HS能使氢分子直接到达肝细胞线粒体产生抗氧化效应，抑制肝细胞线粒体功能损伤及超微结构改变，以达到减轻缺血再灌注肝功能损伤的作用，为氢分子的治疗应用提供了亚细胞水平上的依据。具有广泛的临床应用前景。利用氢作为抗氧化物质治疗疾病现已经成为医学生物界新的研究热点。理论上看，氢与自由基反应的产物是水，多余的氢可自动释放到体外，对人体无毒性作用。目前，对于HS的研究多集中于动物实验，国内外已有饮用氢水进行临床试验的报道［12-15］，国内已有医院正在申请HS进入临床试验阶段。由于氢气的制备方法非常成熟，价格便宜，如果HS将来成功应用于临床，可有效提高疾病治疗效果，显著降低治疗费用。

1 Peglow S,Toledo AH,Anaya-Prado R,et al.Allopurinol and xanthine oxidase inhibition in liver ischemia reperfusion[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2011,18(2):137-146.

2 Wang CC,Zhang PJ.Targeting mitophagy for the treatment of liver diseases[J].Chin Arch Gen Surg(Electronic Edition),2013,7(5):397-399.[王超臣,张培建.线粒体自噬在肝相关疾病中的作用[J].中华普通外科学文献(电子版),2013,7(5):397-399.]

3 Sun CK,Zhang XY,Sheard PW,et al.Change in mitochondrial membrane potential is the key mechanism in early warm hepatic ischemia-reperfusion injury[J].Microvasc Res,2005,70(1-2):102-110.

4 Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K,et al.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nat Med,2007,13(6):688-694.

5 Liu Q,Shen WF,Sun HY,et al.Hydrogen-rich saline protects against liver injury in rats with obstructive jaundice[J].Liver International,2010,30(7):958-968.

6 Chen H,Sun YP,Hu PF,et al.The Effects of Hydrogen-Rich Saline on the Contractile and Structural Changes of Intestine Induced by Ischemia-Reperfusion in Rats[J].Journal of Surgical Research,2011,167(2):316-322.

7 Buchholz BM,Kaczorowski DJ,Sugimoto R,et al.Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intestinal graft injury[J].Am J Transplant,2008,8(10):2015-2024.

8 Bhogal RH,Curbishley SM,Weston CJ,et al.Reactive oxygen species mediate human hepatocyte injury during hypoxia/reoxygenation[J].Liver Transpl,2010,16(11):1303-1313.

9 Jaeschke H,Woolbright BL.Current strategies to minimize hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting reactive oxygen species[J].Transplant Rev(Orlando),2012,26(2):103-114.

10 Tan JF,Wang XL,Jin ZH.The latest knowledge of mechanism and prevention of hepatic ischemia reperfusion injury[J].Chinese Journal of Difficult and Complicated Cases,2013,12(12):979-981.[谭金锋,王现雷,金哲浩.肝缺血再灌注损伤机制与防治的最新认识[J].疑难病杂志,2013,12(12):979-981.]

11 Sun K,Xie X,Liu Y,et al.Autophagy lessens ischemic liver injury by reducing oxidative damage[J].Cell&Bioscience,2013,3(1):26.

12 Kang KM,Kang YN,Choi IB,et al.Effects of drinking hydrogen-rich water on the quality of life of patients treated with radiotherapy for liver tumors[J].Med Gas Res,2011,1(1):11.

13 Xia C,Liu W,Zeng D,et al.Effect of hydrogen rich water on oxidative stress,liver function and viral load in patients with chronic hepatitis B[J].Clin Transl Sci,2013,6(5):372-375.

14 Nakao A,Toyoda Y,Sharma P,et al.Effectiveness of hydrogen rich water on antioxidant status of subjects with potential metabolic syndrome-an openlabel pilot study[J]J Clin Biochem Nutr,2010,46(2):140-149.

15 Matsumoto S,Ueda T,Kakizaki H.Effect of supplementation with hydrogen-rich water in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome[J].Urology,2013,81(2):226-230.