1，3-β-D-葡聚糖和抗白念珠菌芽管抗体检测对侵袭性念珠菌病诊断的临床价值

何力志，石国民，胡方兴

(1.湖南省第二人民医院，湖南长沙410007;2.长沙市中心医院，湖南长沙410004;3.长沙市第三医院，湖南长沙410015)

随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂及抗肿瘤药物等的广泛应用，侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的发病率逐年升高，病死率高达49%[1]。大量的临床资料表明，IC的转归很大程度取决于早期诊治，而现有的IC诊断指标存在一定的局限性[2]。近年研究发现侵袭性真菌感染后人体内可以检测到一些特异性抗原或抗体成分。抗白念珠菌芽管抗体(anti-Candida albicans germ tube antibody，CAGTA)是一种保护性抗体，早期检测有助于 IC 的诊断[3]，而1，3-β-D-葡聚糖(1，3-beta-D-glucan，BG)作为一种广谱真菌标志物，对诊断IC的特异性和阳性预测值较高，但有一定假阳性[4]。因此，我们对BG和抗CAGTA进行联合检测，以探讨其对IC的诊断和治疗监测的价值。

材料和方法

一、研究对象

收集2011年6月至2012年6月湖南省第二人民医院、长沙市中心医院及长沙市第三医院血液科、呼吸科、重症监护病房(intensive care unit，ICU)、肿瘤科、肾内科、老年科、儿科等疑诊为IC的病例252例，其中男162例，女90例。IC诊断标准:按欧洲癌症治疗研究组织(European Organization for Research on Treatment of Cancer，EORTC)和美国国立变态反应与传染病研究所霉菌病研究组(the United States National Institute of Allergy and Infectious Disease Research Institute Mycoses Study Group，NIAID-MSG)2007 年修订的侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)诊断标准及国内相关学会制定的各科侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)诊治指南，参照文献[5]，将IC诊断分为确诊、临床诊断、拟诊及排除IC。符合以上确诊或临床诊断的患者为感染组(阳性者培养鉴定均为念珠菌)。定植组:为无深部真菌感染的基础疾病或临床表现的门诊体检者，每人的痰、粪、尿标本多次涂片镜检均未见菌丝或孢子，其中单一标本培养鉴定为念珠菌。

二、标本采集

每个疑诊为IC的患者均进行影像学检查、病原学检查(血培养、痰培养、痰真菌涂片);部分患者行纤维支气管镜检查，收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAL)进行病原菌培养，以及经支气管肺活检或计算机断层扫描引导下肺穿刺行组织培养或病理学检查，特殊患者留取腹腔和胸腔积液做真菌培养。定植组收集痰、粪、尿标本做直接镜检和培养。感染组患者在第1周静脉采血2次，以后每周采血1次，全部患者连续监测的时间为4周～2个月，或至患者死亡，或排除IC诊断为止。定植组患者采血次数同上。每个患者分别采取血清和肝素抗凝的血浆标本各2 mL，分离血清或血浆，冻存于-70℃冰箱备检。分离菌株常温保存。

三、抗真菌治疗

感染组患者给予广谱抗真菌治疗，在接受治疗2周后评价临床症状、体征、放射学、病原学改变以及疗效。

四、试剂与仪器

所用的API20C-AUX鉴定试剂、沙堡罗培养基均为法国梅里埃公司产品;MB-80微生物动态快速检测系统、T01智能恒温仪、冰浴槽以及GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒均为北京金山川科技发展公司产品。兔抗人多克隆IgG/异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)抗体为Sigma公司产品。

五、血BG检测

取感染组和定植组的待检血浆进行BG检测，具体操作严格按说明书进行。厂家提供的对照血浆中真菌BG＜10 ng/L为正常，10～50 ng/L为可疑，≥50 ng/L为阳性。

六、间接免疫荧光法检测抗CAGTA

首先制作具有芽管抗原的载玻片，然后制备孢子悬液，用于吸附感染组和定植组待检血请中的孢子抗体。血清吸附后，再采用间接免疫荧光试验检测抗CAGTA。结果判定和具体操作参照文献[6]进行。

七、统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。以感染组为真阳性，定植组为真阴性作四格表，分析评价抗CAGTA试验和BG单独以及二者联合应用后诊断IC的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值。率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、病例资料

确诊为IC患者5例，临床诊断为IC患者21例，感染组共计26例。定植组100例。

二、BG结果分析

确诊为IC的5例患者BG均为阳性，临床诊断为IC的21例患者中有11例BG为阳性。100例定植组中有10例BG阳性。BG对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。

三、抗CAGTA结果分析

确诊为IC的5例患者抗CAGTA均为阳性，临床诊断为IC的21例患者中有10例抗CAGTA为阳性。100例定植组中有17例抗CAGTA阳性。抗CAGTA对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为 57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

四、BG和抗CAGTA联合检测的诊断能力

感染组抗CAGTA阳性15例、BG阳性16例，其中14例为同一患者。当BG和抗CAGTA同时阳性时，2组试验数据的动力学变化相一致。

当定植组抗CAGTA或BG出现阳性时，会出现抗GAGTA或BG含量突然上升的现象，然后随着病程的推移，未经抗真菌治疗自动转阴，见图1、2。另外定植组无患者抗CAGTA和BG同时阳性，二者之间无对应性。

BG和抗CAGTA联合检测对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为53.8%、100.0%、100.0%、89.3%，与单项检测相比，敏感性、阴性预测值差异均无统计学意义(P＞0.05)，但特异性和阳性预测值均明显提高(P ＜0.05)，均达100.0%。

图1 定植组BG阳性时平均BG值变化

图2 定植组抗CAGTA阳性时平均抗体值变化

五、抗真菌治疗疗效与抗CAGTA和BG含量变化的关系

感染组BG阳性16例，在接受抗真菌治疗后，14例有效，2例无效。以采血时间第1、8、12、16、20、24、28、32、36、40 天各检测点平均 BG 含量作图，其变化趋势见图3。治疗无效组BG值总体呈上升趋势;治疗有效组BG含量均值呈下降趋势，最后达到正常。感染组抗CAGTA阳性15例，在接受抗真菌治疗后，13例有效，2例无效。以各检测点平均抗CAGTA含量作图，其变化趋势见图4。从图3、4可以看出，感染组抗真菌治疗后，抗CAGTA与BG动力学变化规律一致。同时，结合临床资料显示，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已开始呈现阳性，早于临床抗真菌治疗。

图3 治疗有效组与无效组的平均BG含量变化

图4 治疗有效组与无效组的平均抗CAGTA含量变化

讨 论

IFI时，BG可从真菌细胞壁释入血中，而浅表感染或定植时BG极少释放入血。因此在人体液和组织中检测到BG往往提示IFI[7]。目前，国内外对BG的研究较多，其对IC的诊断作用日益明确。在EORTC/NIAID-MSG诊断IFD的标准中已将BG连续2次阳性作为阳性标准。本研究结果显示BG对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为 61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。与 kondori等[8]的研究结果(BG 检测的敏感性为70% ～100%、特异性为87% ～96%)有一定差距，但与武建国等[6]的报道(敏感性为63.6%、特异性为 90.8%)相近，可能由于所使用试剂盒及病例等不同所致。上述研究结果显示BG诊断IC仍有一定的假阳性。据报道，菌血症患者的假阳性率约60%，革兰阳性球菌菌血症高达73%[9]。其他引起假阳性的原因还包括:溶血、γ球蛋白或凝血因子、某些药物干扰、血液透析用纤维素膜、暴露于含葡聚糖的面绷带、中暑及其他未知原因等。

白念珠菌由酵母相转变为菌丝相过程中形成芽管。西班牙科学家首先在播散性白念珠菌患者的血清中检测到芽管抗体，并证实了人们提出的芽管是白念珠菌由定植菌向致病菌转变的标志。抗CAGTA诊断IC的总体敏感性为77%～89%，特异性为91% ～100%[10];在其他念珠菌如热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等引起的侵袭性感染中也可呈现阳性反应[11]。尽管学者们对检测抗体诊断IC一直存在疑虑:认为免疫功能受到抑制的患者可能检测不出相应抗体，另外抗体阳性患者需排除真菌在体内定植。但最近也有文献报道，免疫功能低下家兔Western blot条带多于免疫功能正常的家兔，其原因可能为前者的抗原清除能力减弱，反而刺激机体产生相应的抗体[12]。另有文献报道，免疫功能低下的SC家兔产生抗烯醇化酶抗体的能力与免疫功能正常的SC家兔相似[13]。本研究结果显示，免疫功能低下患者依然能产生抗体，抗CAGTA对IC诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别达57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

本研究对BG和抗CAGTA进行联合检测，结果表明感染组中抗CAGTA阳性15例、BG阳性16例，其中14例为同一患者。定植组无一例患者抗CAGTA和BG同时阳性，二者之间无对应性;而且当抗CAGTA或BG阳性时，会出现二者含量突然上升，没有经抗真菌治疗，随病程推移自动转阴的现象。这种差异具有重要意义，借此可以排除IC诊断的假阳性。BG和抗CAGTA联合检测诊断IC的敏感性、阴性预测值与单项检测相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，但特异性和阳性预测值明显提高(P＜0.05)，分别达100.0%。这说明 BG和抗CAGTA联合检测明显优于单项检测。

从图3和图4并结合临床资料可以发现，在对感染组进行抗真菌治疗前，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已经是阳性了。治疗有效组随着抗真菌治疗时间的延长，BG和抗CAGTA含量逐渐下降;治疗无效组BG和抗CAGTA含量呈持续上升趋势。这说明动态检测BG和抗CAGTA含量对临床疗效观察和早期诊断具有一定意义，但具体应用价值仍待进一步研究。

综上所述，联合监测BG和抗CAGTA不仅能提高IC诊断的特异性和阳性预测值，而且对IC的早期诊断和治疗监测具有潜在应用价值;同时也为实验室无创、快速和特异地鉴定IC病原体提供了科学依据。

[1]Sá MB，Zaragoza R.Critical overview of clinical guidelines relating to invasive fungal infections[J].Int J Antimicrob Agents，2008，32(Supp12):S155-S159.

[2]李 真，左绪磊.侵袭性念珠菌病的实验室诊断研究进展[J].检验医学，2007，22(1):102-104.

[3]Zaragoza R，Pemán J，Quindós G，et al.Clinical significance of the detection of Candida albicans germ tube-specific antibodies in critically ill patients[J].Clin Microbiol Infect，2009，15(6):592-595.

[4]Ostrosky-Zeichner L，Alexander BD，Kett DH，et al.Multicenter clinical evaluation of the(1-＞3)beta-D-glucan assay as an aid todiagnosisoffungal infections in humans[J].Clin Infect Dis，2005，41(5):654-659.

[5]武建国.关注侵袭性真菌感染的实验诊断[J].临床检验杂志，2010，28(2):87-89.

[6]钱丽洁，朱 敏，李 莉，等.系统性白念珠菌病患者血清中芽管抗体的检测[J].中华皮肤科杂志，2006，39(8):460-462.

[7]Kohno S，Mitsutake K，Maesaki S，et al.An evaluation of serodiagnostic tests in patients with candidemia:beta-glucan，mannan，candida antigen by Cand-Tecand D-arabinitol[J]. Microbiol Immunol，1993，37(3):207-212.

[8]Kondori N，Edebo L，Mattsby-Baltzer I.Circulating beta(1-3)glucan and immunoglobulin G subclass antibodies to Candida albicans cell wall antigens in patients with systemic candidiasis[J].Clin Diagn Lab Immunol，2004，11(2):344-350.

[9]Koo S，Bryar JM，Paqe JH，et al.Diagnostic performance of the(1→3)-beta-D-glucan assay for invasive fungal disease[J].Clin Infect Dis，2009，49(11):1650-1659.

[10]Quindós G，Moragues MD，Pontón J.Is there a role for antibody testing in the diagnosis of invasive candidiasis[J].Rev Iberoam Micol，2004，21(1):10-14.

[11]García-Ruíz JC，del Carmen Arilla M，Regúlez P，etal. Detection ofantibodiesto Candida albicans germ tubes for the diagnosis and therapeutic monitoring of invasive candidiasis in patients with hematologic malignancies [J].J Clin Microbiol，1997，35(12):3284-3287.

[12]孔小祥，李芳秋，王仕钦，等.用动物模型评估抗烯醇化酶抗体测定对系统性白念珠菌病的诊断价值[J].临床检验杂志，2011，29(1):69-71.

[13]孔小祥，李芳秋，王仕钦，等.抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值[J].临床检验杂志，2011，29(6):413-415.