异子蓬二型性种子萌发对盐胁迫的响应

宋以刚，李利 ，曾歆花，邓敏，张希明

(1.中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆乌鲁木齐830011;2.中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海201602;3.中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，河北石家庄050021;4.中国科学院大学，北京100049)

果实(种子)异型性是指同一植株产生不同形态或行为果实(种子)的现象，行为的差异主要体现在传播能力和萌发差异等方面［1-2］。种子异型性是植物本身的遗传特性和环境因素共同作用的结果，是植物为了适应恶劣环境而长期进化形成的一种生理、生态机制［2-3］。

异子蓬(Suaeda aralocaspica)是苋科(Amaranthaceae)藜亚科(Subfamily:Chenopodiaceae)碱蓬属的一年生草本盐生植物［4］。异子蓬主要分布于中亚及黑海沿岸，在我国仅分布于新疆准噶尔盆地南缘的盐碱化沙质土及戈壁上［5］。目前，在新疆境内异子蓬的生境呈片段化分布，主要集中于准噶尔盆地南缘的一些盐碱化严重且地下水位较高的干扰生境中。异子蓬的同一个植株上能够产生形态差异明显的2种类型果实:具有棕色种子的大型果和具有黑色种子的小型果;其种子差别明显，具有显著的种子二型性［5］。

盐生植物种子萌发对盐分的响应主要有2种方式:1)避盐，高盐诱导种子休眠，保持胚胎活力;2)耐盐萌发，胚胎具有较强的耐盐性，保证胚胎的成活［6-7］。异子蓬的二型性种子在萌发和休眠上具有显著性差异，棕色种子没有休眠且有耐高盐的能力;而黑色种子的耐盐能力差，休眠类型为非深度生理休眠［8-9］。异子蓬的二型性种子正好包含这2种策略，但已有的研究只是从萌发生态上阐明了这一现象，并没有深入探讨二型性种子在盐胁迫下产生萌发差异的原因。

异子蓬棕色种子能够在高盐胁迫的条件下萌发，其刚伸长的小幼苗将面临更显著的盐分胁迫，而它是怎样适应盐分胁迫的，目前尚不清楚。因此，本研究的目的在于:比较异子蓬二型性种子的渗透调节物质和盐胁迫下萌发特性的差异，以及在盐胁迫下萌发的棕色种子胚根和胚芽适应高盐环境的不同策略。

1 材料与方法

1.1 种子采集处理及生境描述

异子蓬的新鲜种子于2010年10月3日采集于新疆阜康县境内(N 44°04'，E 87°45')，采集后在通风条件下晾干，4℃冷藏保存备用。通过野外观察发现，异子蓬生长在地下水位较浅且盐碱化较为严重的准噶尔盆地南缘，生境呈片段化分布，其自然种群一般是单一优势种的片层，极少有伴生种。

1.2 二型性种子渗透调节物质的检测

选取成熟饱满的棕色和黑色种子，每种类型的种子称取3份，每份准确称取0.2 g，共称取6份。用3 mL浓硫酸和2 mL高氯酸进行硝化，定容至100 mL，取5 mL原液用凯氏定氮仪检测全氮含量，再取2 mL原液用紫外分光光度计检测全磷含量。另外，分别利用蒽酮比色法和改良型Lowry法对二型性种子内的可溶性糖和可溶性蛋白质进行检测［10］。

1.3 二型性种子萌发对盐胁迫的生理响应

选择成熟饱满的黑色种子和棕色种子进行萌发实验，实验共设置5个NaCl浓度梯度(200，400，800，1200，1600 mmol/L)和一个对照组(0 mmol/L)，每组设置3个重复，每个重复30粒种子。实验在铺有2层滤纸、直径为9 cm的培养皿中进行，培养皿置于20℃、无光照的培养箱中培养21 d(3 d换1次溶液以保证盐浓度的准确性)。实验一，对处理24 h后的所有种子用去离子水冲洗3次后烘干，去除种皮，利用火焰光度计法测量胚胎内的K+、Na+含量。实验二，每隔2 d观察一次萌发的棕色种子(种子完全解螺旋，并且胚根开始生长视为完全萌发)。把每天萌发的种子从胚轴中间截断分为胚根和胚芽两部分，分别用游标卡尺测量其长度，并称取它们的鲜重，去离子水冲洗后置于70℃下48 h烘干，称其干重。把21 d内所有萌发的棕色种子(萌发率小于1/3的未作此处理，即NaCl浓度＞1200 mmol/L)，烘干后，用火焰光度计分别检测胚根和胚芽中K+、Na+的含量［11-12］。

生物量指标共分为以下几部分:总鲜重、胚根鲜重、胚芽鲜重、总干重、胚根干重、胚芽干重。胚根含水量=(胚根鲜重－胚根干重)/胚根鲜重、胚芽含水量=(胚芽鲜重－胚芽干重)/胚芽鲜重，胚根干重比=胚根干重/总干重、胚芽干重比=胚芽干重/总干重、胚根胚芽干重比=胚根干重/胚芽干重，总长度、胚根长度、胚芽长度、胚根长度比、胚芽长度比、胚根胚芽长度比、表型可塑性指数(phenotypic plasticity index，PI)=处理中某一性状的最高值减去最低值后除以最高值［13］。

1.4 数据处理与分析

数据统计与作图采用Microsoft Office Excel 2003和Origin 8.0进行。数据分析采用SAS 9.1.3软件，实验中均进行3个重复，同一类型不同处理间采用方差分析(ANOVA)进行差异显著性比较，不同类型种子的同一处理间比较采用T检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 异子蓬二型性种子渗透调节物质的差异

异子蓬棕色种子的可溶性糖(P＜0.05)、可溶性蛋白质含量(P ＜0.01)、全氮(P＜0.0001)和全磷(P＜0.0001)都显著高于黑色种子(表1)。其中，棕色种子的可溶性糖大约是黑色种子的1.5倍，说明棕色种子主要渗透调节物质的含量相当丰富。

表1 异子蓬二型性种子渗透调节物质的含量(平均值±标准误差)及其差异显著性分析Table 1 The content(mean±SE)and significance of difference analysis about the osmotic adjustment substances in the dimorphic seeds of S.aralocaspica g/kg

2.2 盐分对异子蓬二型性种子的离子毒害作用

异子蓬二型性种子对盐胁迫的响应有着明显的差异。经过24 h盐胁迫以后，随着NaCl浓度的升高，棕色种子胚胎的Na+含量显著升高，而K+的含量只有在NaCl浓度达到1600 mmol/L时才开始出现显著的降低。然而，随着NaCl浓度的升高，黑色种子胚胎的Na+和 K+的含量都没有显著性差异。另外，所有NaCl胁迫下，棕色种子的Na+和K+的含量都高于黑色种子(图1)。

2.3 棕色种子萌发后胚根和胚芽对盐胁迫的离子响应

棕色种子萌发以后，随着NaCl浓度的增大，胚根和胚芽中的Na+含量都显著增加，均在1200 mmol/L时达到最大值。胚根中Na+的含量除在400 mmol/L和800 mmol/L之间无显著差异外，其余各浓度梯度间均有显著性差异;胚芽中Na+的含量在NaCl浓度达到800 mmol/L以后没有显著升高。通过T检验发现，同一浓度下(对照除外)胚根和胚芽中Na+含量均存在显著性差异(P＜0.01)。胚根K+对盐胁迫较为敏感，在200 mmol/L的NaCl浓度下，其含量就显著降低;但是，随着NaCl浓度的进一步升高，K+含量维持在一个相对稳定的水平上，变化不明显。胚芽中K+的含量没有受NaCl浓度的影响，随着NaCl浓度的升高，K+含量没有显著的变化规律。另外，通过T检验发现，同一浓度下胚根和胚芽中K+的含量均存在显著性差异(P＜0.05)，随着NaCl浓度的升高，胚芽K+含量均显著高于胚根(图2)。

图1 培养24 h后异子蓬二型性种子胚胎Na+和K+含量(平均值±标准误差)随NaCl浓度的变化Fig.1 The content of K+and Na+(mean ±SE)in embryo of dimorphic seeds in S.aralocaspica after incubated 24 h at different concentrations of NaCl

图2 不同NaCl浓度下异子蓬棕色种子萌发后胚根和胚芽中Na+和K+的含量(平均数±标准误差)变化Fig.2 The content of K+and Na+(mean ±SE)in radicle and germ of germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

棕色种子在盐胁迫下(与0 mmol/L对照相比)萌发以后，胚根和胚芽中的K+/Na+均显著降低。随着NaCl浓度的升高，胚根的K+/Na+显著降低;胚芽的K+/Na+没有显著性差异。T检验发现在相同浓度下胚根的K+/Na+都显著低于胚芽(P＜0.05)(图3)。

图3 异子蓬棕色种子萌发后胚根和胚芽中K+/Na+(平均数±标准误差)随NaCl浓度的变化Fig.3 The K+/Na+(mean ±SE)in radicle and germ in germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

2.4 胚根和胚芽鲜重、干重和含水量的差异

胚根的鲜重均高于胚芽的鲜重;但是随着NaCl浓度的升高，胚根和胚芽鲜重的变化规律有着明显的不同，胚根鲜重与0 mmol/L的对照相比没有显著性差异，但是胚芽鲜重有明显的降低。另外，胚根和胚芽鲜重的极值均出现在NaCl浓度为400 mmol/L处(表2)。

胚根和胚芽的干重分配正好与鲜重相反，胚芽干重均大于胚根干重。随着NaCl浓度的升高，胚根干重逐渐增大，除在200和400 mmol/L之间无差异外，其余各浓度之间的差异均达到显著水平。总干重和胚芽干重在不同NaCl浓度下无显著性差异。另外，通过T检验得出，胚芽干重除在400和1200 mmol/L的NaCl浓度下以外，均显著高于胚根干重(P＜0.01)(表2)。

另外，随着NaCl浓度的升高，胚根含水率和胚芽含水率逐渐下降。通过T检验发现，相同NaCl浓度下，胚根含水率都显著高于胚芽含水率(P＜0.01)(表2)。

胚根干重比和胚芽干重比反映了生物量在胚根和胚芽之间分配的比例。从表2可以看出，胚根干重比随着NaCl浓度的升高整体呈上升趋势，在NaCl浓度为1200 mmol/L达到最高;而胚芽干重比整体呈下降的趋势，在0 mmol/L处为最大。胚根干重比和胚芽干重比的显著性差异转折点均出现在400 mmol/L处。相同NaCl浓度下，胚芽干重比均高于胚根干重比，且通过T检验得出，除NaCl浓度为1200 mmol/L外，其他浓度下胚根干重比和胚芽干重比均呈显著性差异(P＜0.01)。胚根胚芽干重比在不同NaCl浓度下均有显著性差异，且在1200 mmol/L时达到最大值(表2)。

表2 不同NaCl浓度下异子蓬棕色种子萌发后胚根和胚芽生物量指标的差异Table 2 The difference of biomass index in radicle and germ in germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

2.5 胚根和胚芽生长速度及表型可塑性分析

随着NaCl浓度的逐渐升高，总长度和胚芽长度逐渐下降，各浓度梯度间差异显著;胚根长度则是先增加后减小，在200 mmol/L时达到最大值。相同NaCl浓度下，胚根长度均显著大于胚芽长度(P＜0.05)(表2)。

胚根长度比和胚根胚芽长度比随着NaCl浓度升高逐渐增大，而胚芽长度比则逐渐减小。胚根长度比、胚芽长度比和胚根胚芽长度比除在200和800 mmol/L之间无显著性差异外，其他各浓度之间均有显著性差异(表2)。

随着NaCl浓度的增大，总长度、胚根长度和胚芽长度的表型可塑性指数逐渐下降，所以NaCl浓度越高，胚根和胚芽的形态可塑性就越低。通过T检验得出，相同NaCl梯度下，胚芽的表型可塑性指数均显著高于胚根的表型可塑性指数(P＜0.05)(图4)。

3 讨论

植物在长期的环境适应过程中，进化形成了应对恶劣环境的独特机制［14］。在恶劣环境中保证一定种群数量的存活是维持物种稳定的重要手段之一，产生不止一种类型的种子能够降低时间适合度的变异，从而确保至少一部分后代在剧烈变化的环境中存活［3］。为了适应中亚地区的干旱和盐碱环境，异子蓬经过长期的进化也形成了产生异型性种子的适应机制，其产生的二型性种子在形态和生理上都有着显著的差异，黑色种子不耐盐、具有非深度生理休眠，而棕色种子耐盐能力强、无休眠［9］。

在新疆准格尔盆地南缘异子蓬的生境中，盐分的分布主要集中在表层且分布的差异性较大，表层盐分分布最小值只有300 mmol/L左右，最大值达到1300 mmol/L［9］。异子蓬的二型性种子在土壤表层以何种方式应对这种高盐环境，保证每年种群数量的稳定至关重要。已有研究发现，许多盐生植物和非盐生植物物种的幼苗和胚根在NaCl浓度达到200～400 mmol/L时仍能够继续生长［15-19］。细枝盐爪爪(Kalidium gracile)和盐爪爪(Kalidium foliatum)在NaCl浓度达到400 mmol/L左右时，对胚根没有损害［7，20-21］。在如此恶劣的盐碱环境中，盐生植物的种子在萌发初期是怎样躲避盐离子的毒害值得探讨。

图4 异子蓬棕色种子完全萌发后总长度、胚根长度和胚芽长度的表型可塑性指数随NaCl浓度的变化Fig.4 Phenotypic plasticity index(mean ± SE)for total length，radicle length and germ length of completely germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

3.1 异子蓬二型性种子对盐胁迫的不同适应策略

盐生植物的渗透调节物质主要是一些有机可溶性物质和无机离子，这些物质的含量高低是植物耐盐能力的重要依据［22-23］;高含量的养分物质是提高种子对逆境忍受力的重要保证［24］。异子蓬棕色种子的可溶性糖、可溶性蛋白质、全氮和全磷这些有机可溶性物质都显著高于黑色种子，说明棕色种子的耐盐能力显著高于黑色种子。另外，已有研究发现，棕色种子的无机离子含量均显著高于黑色种子［25］。综合分析，我们发现棕色种子在渗透调节物质上的优势，与棕色种子在盐胁迫下能够迅速吸水萌发的报道完全吻合［9］。

高盐环境下，植物体内维持正常的矿质营养元素与Na+比值是植物耐盐性的生理表现之一，盐胁迫下植物体内保持较高的K+浓度(K+/Na+)对维持正常的代谢十分重要［11，26-27］。在受到盐胁迫时，棕色种子的K+始终维持在一个很高的水平;并且棕色种子的K+含量始终高于黑色种子，这些都是棕色种子能够在高盐胁迫下萌发的重要物质保障。棕色种子胚芽中的K+含量显著高于胚根，这是保证胚芽中有机物质进行代谢，促进胚芽生长的物质基础。另外，当NaCl浓度大于200 mmol/L时，胚根K+的浓度保持稳定，也是维持正常代谢并确保其迅速生长，脱离土壤表层的高盐环境的重要保障。棕色种子胚芽的这种维持较高K+/Na+的方式是其降低盐害保持细胞活力的重要策略之一。

作为真盐生植物，可在体内积累较高浓度的无机离子来降低渗透势，其中主要是Na+，以便于能在含盐量很高的土壤中吸收水分［28］。当环境盐分过高，植物吸收大量Na+后，会造成离子稳态的破坏，即当植物吸收过多Na+的同时，会导致植物体内的K+等营养离子的大量流失［29］。随着盐浓度的增大，胚根和胚芽中Na+的含量都显著增加，以降低体内的渗透势，保证种子吸水，为其在高盐环境中萌发提供了有力的保证。

3.2 棕色种子的胚根和胚芽对盐胁迫下生物量响应

萌发初期，胚根生长在含盐量较高的土壤中，为了减少盐分对胚根内部结构的损害，胚根通过吸收大量的水分来缓解离子毒害［30-31］。棕色种子萌发后胚根的含水量高，并且显著高于胚芽;随着盐分增加，胚根Na+含量和干重都显著增加，所以大量吸水是棕色种子完全萌发后胚根应对盐胁迫的策略之一。在离子变化幅度较小的前提下，胚芽干重显著高于胚根干重，说明胚芽的有机物质含量较高，是其提高细胞的渗透压，避免大Na+大量进入细胞产生毒害作用的物质基础。所以我们推测，胚根主要通过大量吸水来稀释盐离子的毒害作用，而胚芽可能主要靠体内的大量的渗透调节物质来抵抗盐离子的毒害。

萌发时胚根的迅速生长也是胚胎躲避表层土壤盐胁迫的重要策略之一，异子蓬棕色种子在不同盐分梯度下完全萌发时胚根伸展的长度均能达到2 cm左右，胚根长度比随着盐浓度的增大逐渐增大，说明在高盐胁迫下，胚胎的生长主要分配给胚根，以期能够迅速摆脱高盐环境。形态可塑性是植物能够适应多样化生境的重要原因之一，高的可塑性使其具有较宽的生态幅和拓殖能力，从而缓解生境的选择压力［32］。异子蓬棕色种子的胚根在NaCl浓度达到800 mmol/L时，其表型可塑性依然较高，说明它对盐胁迫具有较强的适应能力。

4 结论

综上所述，异子蓬的二型性种子在盐胁迫下体现出了不同的适应策略，黑色种子萌发受到盐分的抑制，以休眠的状态逃避高盐环境;而棕色种子高含量的渗透调节物质不但使其能够在高浓度的盐胁迫下迅速吸水萌发，还为其萌发后迅速生长以躲避盐害并保证植株的正常存活提供了有利的物质基础。棕色种子萌发以后，胚根受盐离子的毒害较为明显，但是胚根和胚芽以不同的方式来化解了盐离子的毒害，胚根通过迅速的大量吸收水分稀释盐离子的毒害作用，并且迅速伸长摆脱土壤表层的高盐环境;而胚芽则依赖其子叶的干重优势和较高K+/Na+来抵御Na+的毒害作用。这些在长期进化过程中形成的适应机制是异子蓬在不稳定的西北干旱区的盐碱环境中维持种群稳定的重要生存智慧。

［1］Venable D L.The evolutionary ecology of seed heteromorphism［J］.American Naturalist，1985，126:577-595.

［2］Imbert E.Ecological consequences and ontogeny of seed heteromorphism［J］.Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics，2002，5:13-36.

［3］王雷，董鸣，黄振英.种子异型性及其生态意义的研究进展［J］.植物生态学报，2010，34(5):578-590.

［4］Missouri.密苏里植物园植物资料库［EB/OL］.(2005)［2013-09-27］.http://www.tropicos.org/Name/50338254.

［5］李安仁.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1979.

［6］Ungar I A.Halophyte seed germination［J］.Botanical Review，1978，44:233-264.

［7］Qu X X，Baskin J M，Wang L，et al.Effects of cold stratification，temperature，light and salinity on seed germination and radicle growth of the desert halophyte shrub，Kalidium caspicum(Chenopodiaceae)［J］.Plant Growth Regulation，2008，54:241-248.

［8］李利，杨小林，王伟华.异子蓬二态性种子萌发对生境条件的响应［J］.干旱区研究，2007，24(6):6830-6834.

［9］Wang L，Huang Z Y，Baskin C C，et al.Germination of dimorphic seeds of the desert annual halophyte Suaeda aralocaspica(Chenopodiaceae)，a C(4)plant without Kranz Anatomy［J］.Annals of Botany，2008，102:757-769.

［10］宋松泉，程红焱，龙春林，等.种子生物学研究指南［M］.北京:科学出版社，2005.

［11］高奔，宋杰，刘金萍，等.盐胁迫对不同生境盐地碱蓬光合及离子积累的影响［J］.植物生态学报，2010，34(6):671-677.

［12］武高林，陈敏，杜国祯.三种高寒植物幼苗生物量分配及性状特征对光照和养分的响应［J］.生态学报，2010，30(1):60-66.

［13］马金虎，郭数进，王玉国，等.种子引发对盐胁迫下高粱幼苗生物量分配和渗透物质含量的影响［J］.生态学杂志，2010，29(10):1950-1956.

［14］Ungar I A.Population ecology of halophyte seeds［J］.Botanical Review，1987，53:301-334.

［15］彭云玲，李伟丽，王坤泽，等.NaCl胁迫对玉米耐盐系与盐敏感系萌发和幼苗生长的影响［J］.草业学报，2012，21(4):62-71.

［16］杨景宁，王彦荣.NaCl胁迫对四种荒漠植物种子萌发的影响［J］.草业学报，2012，21(5):32-38.

［17］Khan M A，Ungar I A.The effect of salinity and temperature on the germination of polymorphic seeds and growth of Atriplex triangularis willd［J］.American Journal of Botany，1984，71:481-489.

［18］Tobe K，Zhang L，Omasa K.Effects of NaCl on seed germination of five nonhalophytic species from a Chinese desert environment［J］.Seed Science and Technology，1999，27:851-863.

［19］Tobe K，Zhang L P，Qiu G Y Y，et al.Characteristics of seed germination in five non-halophytic Chinese desert shrub species［J］.Journal of Arid Environments，2001，47:191-201.

［20］Shen Y Y，Li Y，Yan S G.Effects of salinity on germination of six salt-tolerant forage species and their recovery from saline conditions［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，2003，46:263-269.

［21］曾幼玲，蔡忠贞，马纪，等.盐分和水分胁迫对两种盐生植物盐爪爪和盐穗木种子萌发的影响［J］.生态学杂志，2006，25(9):1014-1018.

［22］Yeo A R，Flowers T J.Salt tolerance in the halophyte Suaeda maritima L.Dum.:Evaluation of the effect of salinity upon growth［J］.Journal of Experimental Botany，1980，31:1171-1183.

［23］刘爱荣，张远兵，钟泽华，等.盐胁迫对彩叶草生长和渗透调节物质积累的影响［J］.草业学报，2013，22(2):211-218.

［24］傅家瑞.种子生理［M］.北京:科学出版社，1985.

［25］宋以刚，李利，张希明，等.异子蓬二型性种子的种皮结构及离子含量差异［J］.植物研究，2012，32(3):290-295，319.

［26］Tester M，Davenport R.Na+tolerance and Na+transport in higher plants［J］.Annals of Botany，2003，91:503-527.

［27］杨小菊，赵昕，石勇，等.盐胁迫对砂蓝刺头不同器官中离子分布的影响［J］.草业学报，2013，22(4):116-122.

［28］Song H，Feng G，Tian C Y，et al.Osmotic adjustment traits of Suaeda physophora，Haloxylon ammodendron and Haloxylon persicum in field or controlled conditions［J］.Plant Science，2006，170:113-119.

［29］高奔，宋杰，刘金萍，等.盐胁迫下囊果碱蓬出苗状况及苗期抗盐性［J］.生态学报，2009，29(11):6131-6135.

［30］李品芳，杨志成.NaCl胁迫下高羊茅生长及K+、Na+吸收与运输的动态变化［J］.草业学报，2005，14(4):58-64.

［31］杨成龙，段瑞军，李瑞梅，等.盐生植物海马齿耐盐的生理特性［J］.生态学报，2010，30(17):4617-4627.

［32］Sultan S E.Phenotypic plasticity for plant development，function and life history［J］.Trends in Plant Science，2000，5:537-542.