黑木相思根瘤菌ACC脱氨酶活性的研究

窦雅静，康丽华，陆俊锟，侯俊杰，朱亚杰

（1.中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520；2.三亚林场，海南 三亚 570000）

黑木相思根瘤菌ACC脱氨酶活性的研究

窦雅静1,2，康丽华1，陆俊锟1，侯俊杰1，朱亚杰1

（1.中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520；2.三亚林场，海南 三亚 570000）

根瘤菌能够利用1-氨基环丙烷-1羧酸（ACC）脱氨酶催化ACC 脱氨基，从而降低植物体内抑制其生长的乙烯含量，促进植物生长。本研究采用茚三酮比色法测定菌株的ACC 脱氨酶活性并对其acdS 基因进行了系统发育分析。结果表明，扩增174 株供试菌株中，151 株检测出ACC 脱氨酶活性，但酶活性差异较大。121株扩增出acdS 基因，菌株的系统发育关系与地理来源具有相关性，中慢生根瘤菌属菌株的acdS 基因具有明显的保守性。菌株ACC 脱氨酶活性的高低与acdS 基因存在与否的相关性有待进一步研究。ACC 脱氨酶活性的检测方法将为快速筛选高效根瘤菌菌株提供可靠的理论依据。

黑木相思；根瘤菌；ACC脱氨酶活性；acdS基因

植物在受到干旱、洪涝、高低温、盐碱及重金属等逆境胁迫和病原微生物侵染时会应激产生大量植物激素乙烯，高浓度的乙烯会抑制植物的生长和发育[1]。1-氨基环丙烷-1-羧酸脱 氨 酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase，简称ACC 脱氨酶）是一种能够抑制植物体内乙烯合成的胞内聚合酶，该酶能将乙烯合成前体ACC 分解为α-酮丁酸和氨[2]。ACC 脱氨酶是细菌促进植物生长的一种重要特性，能够增强植物的抗盐胁迫、抗干旱胁迫、抗重金属污染、抗有害微生物侵染等能力[3]。能够表达ACC脱氨酶基因的根瘤菌的结瘤能力及其豆科宿主的耐受性都比较高[4]。筛选具有ACC 脱氨酶活性的菌株对根瘤菌菌剂的田间应用具有重要的应用意义。

黑木相思Acacia melanoxylonR. Br.是近年来我国南方引种的主要用材树种之一。其木材是优质的贴面板原料，具有很高的经济价值。目前在我国黑木相思原木销售价是每立方米3000 元以上，而且价格有不断上升趋势[5]。随着市场需求增大，黑木相思在华南地区的种植面积逐渐扩大，但黑木相思相比马占相思Acacia mangium、厚荚相思Acacia crassicarpa等相思树种生长较为缓慢。因此，生产上亟需接种根瘤菌来提高黑木相思的生长速度、苗木存活率。

Uchiumi 等[6]发现有些根瘤菌含有ACC 脱氨酶，它们的ACC 脱氨酶结构基因（acdS）在根瘤中的表达量很高，敲除acdS基因后，根瘤菌的结瘤能力会显著降低；相反地，Ma等[7]将acdS 基因导入到原本没有ACC 脱氨酶的根瘤菌中，根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株。ACC 脱氨酶检测通常采用2，4-二硝基苯肼比色法。有些根瘤菌具有acdS 基因[8]，但在自生状态下不表达，只有在与豆科植物共生的根瘤中才能表达[9]。因此，安千里等[10]设计了扩增acdS 基因的两对光谱且特异性的引物acdSf3/acdSr3 和acdSf3/acdSr4，从分子水平检测细菌是否有acdS 基因，这样就排除了根瘤菌的acdS 基因在再自生状态不表达的干扰，实现了具有ACC脱氨酶活性菌株的快速筛选。

本研究采用茚三酮比色法测定菌株的ACC 脱氨酶活性并对其acdS 基因进行了系统发育分析。为快速筛选高效根瘤菌菌株，制作根瘤菌菌剂应用于田间生产提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 黑木相思根瘤菌的采集、分离和纯化

采集：黑木相思根瘤从广东、福建、江西各省8 个市县15 个不同采样点采集，采集到的根瘤放入硅胶干燥管中，带回实验室进行分离和纯化。

分离：将采集到的根瘤用水冲洗干净，并在1.5 mL离心管中泡胀；将水倒掉，加入95%乙醇浸泡1 min；倒掉乙醇，加入0.2%升汞消毒1～3 min；倒掉升汞，用无菌水冲洗根瘤；最后一次冲洗后留少许无菌水在离心管中，捣碎根瘤制成菌悬液，沾取菌悬液在YMA平板上划线，28 ℃培养箱中培养。

纯化：挑取YMA平板上形态像根瘤菌的单菌落再纯化，重复划线1～2次，直至整个平板的菌落形态和大小一致，挑取单菌落接入YMA斜面中，28 ℃培养箱中培养。

1.2 ACC 脱氨酶结构基因（acdS）扩增

1.2.1 acdS 基因扩增引物

acdS基因 PCR 扩增引物参见文献[10]。

1.2.2 acdS 基因扩增反应体系（25 μL）

体系组成见表1。

表1 acdS 基因扩增反应体系Table 1 Amplification reaction system of acdS gene

1.2.3 acdS 基因扩增反应条件

预变性95 ℃，4 min；35×（变性95 ℃ ，45 s；退火53 ℃，45 s；延伸72 ℃，1 min）；延伸72 ℃，10 min。

1.2.4 PCR 产物的检测及序列分析

将 1 μL10×loading buffer 与 5 μL PCR 产 物充分混合，1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，150 V，30 min。电泳结束后，用紫外凝胶成像分析系统扫描照相，检测扩增片段长度与浓度。检测正确的PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将测得的acdS 基因序列提交到GenBank 数据库中，使用NCBI 中的BlAST 软件在线比对，并从GenBank 数据库中下载与待分析序列相近序列。用MEGA 5.1 软件分别对测得的各菌株acdS 基因进行比对，用邻接法构建系统发育树，Bootstrap为1 000。

1.3 ACC 脱氨酶活性测定

本研究采用2，4-二硝基苯肼比色法检测根瘤菌ACC 脱氨酶活性，参见文献[11]。

细菌ACC 脱氨酶的活性计算公式如下：

ACC 脱 氨 酶 活 性 (m·mol)/(mg·h)= 生 成 的 α-酮丁酸的含量/（细菌蛋白含量×0.25 h）

2 结果与分析

2.1 黑木相思根瘤菌的采集、分离和纯化

从广东、福建、江西各省8 个市县15 个不同采样点共分离到174株黑木相思根瘤菌，如表2所示。

2.2 ACC脱氨酶结构基因扩增结果

本实验对174 株供试菌株的ACC 脱氨酶结构基因acdS 基因进行了扩增。先用引物acdSf3/r3进行扩增，共有121 株供试菌株扩增出acdS基因，片段大小为680 bp；将未扩增出acdS基因的菌株再用另一对引物acdSf3/r4进行扩增，共有8 株菌扩增出acdS 基因，片段大小为760 bp。用MEGA 5.1 软件采用邻接法构建聚类分析图，如图1所示。

表2 供试菌株Table 2 Tested strains

续表2The contiouation of table 2

续表2The contiouation of table 2

续表2The contiouation of table 2

174 株供试菌株中，132 株属于慢生根瘤菌属，扩增出acdS 基因的有96 株，占慢生根瘤菌属83%；中慢生根瘤菌有20 株，全部扩增出；根瘤菌属12 株，全未扩增出acdS 基因；伯克霍尔德菌属1株，未扩增出acdS 基因；草螺菌属9 株，其中5 株扩增出acdS 基因，但由于菌株RITF1201、RITF1202、RITF1205、RITF1207 的acdS 基因片段只有200 bp，未加入到聚类分析中。

大部分供试菌株的系统发育关系与地理来源具有相关性，同一地理来源的菌株聚为一群。中慢生根瘤菌属除菌株RITF1564 外，不同地理来源、不同种的菌株均聚为一类，说明中慢生根瘤菌属的acdS 基因很保守，是通过水平转移的方式传递的，这与Francisco 等[8]的研究结果相一致。

2.3 ACC 脱氨酶活性测定

174 株供试菌株中，151 株检测出ACC脱氨酶活性，但酶活性差异较大，从75～36 652 nmol/(mg·h)（见表1）。文献显示，ACC 脱氨酶活性不低于20 nmol /(mg·h) 时，就可促进植物生长[7]。本研究表明，ACC 脱氨酶活性低于600 nmol/(mg·h) 的菌株，不能扩增出acdS 基因。

ACC 脱氨酶活性测定结果与asdS基因扩增结果基本一致。部分菌株ACC脱氨酶活性较高，但也未扩增出acdS 基因，其中RITF1462、RITF1464、RITF1471 属于根瘤菌属，结构基因位于质粒上，而根瘤菌属菌株质粒极易丢失[12]；伯克霍尔德属菌株RITF14113 未扩增出acdS 基因，可能是由于引物不适合。

3 结论与讨论

本研究采用茚三酮比色法测定菌株的ACC 脱氨酶活性并对其acdS 基因进行了系统发育分析。174 株供试菌株中，121 株供试菌株扩增出acdS基因，大部分供试菌株的系统发育关系与地理来源具有相关性，同一地理来源的菌株聚为一群，而中慢生根瘤菌属菌株的acdS基因尤为保守。151株检测出ACC 脱氨酶活性，但酶活性差异较大，所有扩增出acdS 基因的菌株都具有ACC 脱氨酶活性，部分程度上支持了安千里[10]等的研究结果，但是具有acdS 基因的不同菌株的ACC 脱氨酶活性差异很大，从75～36 652 nmol/(mg·h)；另外少数菌株虽具有ACC 脱氨酶活性，但未扩增出acdS 基因，推测是由于质粒丢失造成的。这两种情况说明，只利用基因扩增的方法来筛选高效固氮菌株，很难区分菌株ACC 脱氨酶活性的高低，进而难以判断菌株共生固氮能力的强弱，而不具acdS 基因的菌株也可能具有很高的ACC 脱氨酶活性，容易漏筛。因此，可先测定菌株的ACC 脱氨酶活性，再对无活性的菌株的acdS 基因进行PCR扩增，就可从大量供试菌株中无遗漏的筛选出高效菌株。ACC 脱氨酶活性与固氮能力和苗木生长状况的相关性也有待进一步研究。

菌株ACC 脱氨酶活性的高低与acdS 基因存在与否的相关有待进一步研究。需通过苗木接种实验，进一步研究根瘤菌ACC 脱氨酶活性与固氮效率及苗木生长的相关性。

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ACC deaminase activity of rhizobia associated withAcacia melanoxylon

DOU Ya-jing1,2, KANG Li-hua1, LU Jun-kun1, HOU Jun-jie1, ZHU Ya-jie1
(1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China;2. Sanya Forest Farm, Sanya 570000, Hainan, China)

Rhizobia can catalyze the ACC deaminase by using -aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, thereby reducing the ethylene content in the plants that inhibits the growth of rhizobia and promoting plant growth. The tested bacterial strains were mensurated and theiracdS gene’s phylogenetic development were analyzed. The results show that among the isolated 174 isolates, 151 strains showed ACC deaminase activity, but there were rather differences in enzyme activity; however, the acdS gene of 121 strains were detected which were conserved inMesorhizobiumgenus; the phylogeny of acdS genes was signif i cantly correlated with geographical origin. A further research on the correlation between the level of ACC deaminase activity and the prevalence ofacdS genes is urgently needed. The test method of ACC deaminase will provide a reliable theoretical foundation for rapidly culling high eff i cient rhizobia strains.

Acacia melanoxylon; rhizobia; ACC deaminase activity; acdS gene

S718.43

A

1673-923X(2014)11-0077-07

2014-01-12

农业科技成果转化资金项目”相思根瘤菌肥料关键技术转化及产品示范”（2011GB24320016）；国家林业公益性行业科研专项经费项目“功能微生物在低碳林业中的应用研究”（201004075）

窦雅静（1987-），女，河北玉田人，硕士研究生，主要从事黑木相思根瘤菌方面的研究；E-mail：malibeier0315@126.com

康丽华（1955-），女，研究员，从事应用微生物方面的研究；E-mail：klh587@126.com

[本文编校：吴 毅]