降解β—胡萝卜素葡萄球菌的化学合成培养基研究

贺静+朱明明+王树林+樊明涛

摘 要：以沙棘汁中分离的降解β胡萝卜素葡萄球菌为材料，在完全合成培养基中采用单一成分缺失的方法确定了菌体生长的营养需求，试验结果表明，精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、丰胱氨酸、脯氨酸6种氨基酸和K2HPO4和NaNO3两种无机盐是必需营养素，其他组分或是对菌体生长没有作用，或是尽管对菌体生长有一定的作用，但缺失时对菌体生长不会受到较大影响。

关键词：沙棘；降解β胡萝卜素葡萄球菌；化学合成培养基；单一成分缺失法

中图分类号：TS201.4 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.002

Research on Chemically Defined Medium for β-Carotene-Degrading Staphylococcus sp.

HE Jing1， ZHU Ming-ming1， WANG Shu-lin2， FAN Ming-tao1

（1. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100， China； 2. Agriculture and Animal Husbandry College， Qinghai University， Xining， Qinghai 810016， China）

Abstract： The β-carotene - degrading Staphylococcus sp. was screened from sea-buckthorn，and the nutritional requirements of the Staphylococcus growth by single components deficiency analysis in chemically defined medium were determined. The results showed that the six amino acids Arg， Leu， Trp， Thr， Cys， Pro and two inorganic salts K2HPO4， NaNO3 were essential for chemically defined medium. Other components had lower impact on chemically defined medium and were nonessential.

Key words： sea-buckthorn；β-carotene-degrading Staphylococcus sp.；chemically defined medium；single components deficiency analysis

收稿日期：2013-10-14；修订日期：2013-10-25

基金项目：国家自然科学基金项目（31171728；31060225）

作者简介：贺静（1990—），女，陕西西安人，在读硕士生，主要从事食品生物技术研究。

通讯作者简介：樊明涛（1963—），男，陕西富平人，教授，博士，主要从事食品微生物及食品安全研究。

沙棘又名黑刺、酸刺，因果实中含有丰富的维生素、类胡萝卜素、矿物元素、氨基酸和生物活性物质被称为“天然维生素之王” [1-3]。沙棘广泛分布在中国西北、西南，以沙棘果为原料酿造而成的沙棘果酒，具有增强毛细血管新陈代谢和延缓人体衰老的功能，长期饮用能健胃补脾、抑制心血管疾病的发生，起到抗癌和抗衰老的作用[4-5]。沙棘酒最大的缺陷是香味寡淡，酒香不协调，而沙棘含有丰富的β-胡萝卜素，β-胡萝卜素在微生物酶的作用下，可以降解产生小分子的酮如氧化异佛尔酮、β-大马酮、β-紫罗兰酮、假紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯等[6-9]，这些化合物都是构成沙棘酒香味的重要物质[10-11]。

本研究在酿酒过程中分离出一株可以降解β-胡萝卜素的细菌，经初步鉴定是葡萄球菌，用天然培养基培养该菌，生长良好。但是由于天然培养基含有酵母浸粉，其高粘性不利于后续酶的分离纯化，并且酵母浸粉的组成成分不明确，影响进一步了解微生物的生命活动及其代谢过程[12-15]。所以，有必要优化出一种合成培养基，它既不影响菌的生长，又便于对降解过程产生的酶的研究。本研究的目的在于筛选一种适合于该菌生长和产酶的化学合成培养基，从而为类胡萝卜素降解酶的代谢调控机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌种 葡萄球菌（Staphylococcus sp.）TS-82，本实验室分离筛选。

1.1.2 仪器与设备 UV-3802型比例双光束紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司，Sartorius 标准型PB-10 pH计、电子天平，上海精密科学仪器有限公司； DH-420型电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司。

1.2 培养基

天然培养基为改良察氏培养基，合成培养基是在本实验室麻俊侠[13]的研究基础上优化得到的，不同培养基的成分及配方如表1所示。

1.3 菌种培养及测定

分别取制备好的培养基50 mL置于100 mL的灭菌三角瓶中，将保藏菌种接种于天然培养基A，在37 ℃、130 r·min-1的摇床上振荡培养至对数生长末期，之后将此菌液按5%的体积比接种于合成培养基B，采用UV-3802型比例双光束紫外-可见分光光度计测定其在培养基生长的最大生物量，以未接种的培养基作为空白。培养完成后，培养液在4 ℃、8 000 r·min-1离心20 min，得到粗酶液，用于测定降解能力。

1.4 β-胡萝卜素储备液的制备

在避光条件下，将5 mg β-胡萝卜素溶于10 mL的二氯甲烷中，待β-胡萝卜素彻底溶解后加入1 g吐温-80，使二氯甲烷完全挥发，再加入50 mL无菌蒸馏水混匀，得橘黄色、清澈的储备液，置于4 ℃冰箱中待用。

1.5 β-胡萝卜素标准曲线的绘制及含量测定

分别取β-胡萝卜素储备液0，20，40，60，80，100，

120，140 μL，加蒸馏水至3.25 mL，以蒸馏水做空白，于460 nm波长处测其吸光度，用所得数据作图可得β-胡萝卜素溶液浓度与吸光度的线性关系，浓度与吸光度的线性关系式：

y =14.97x-0.173 （R2=0.990）

式中，x为β-胡萝卜素水溶液的吸光度，y为β-胡萝卜素在水溶液中的浓度（μmol·L-1）。

1.6 化学合成培养基单一成分缺失试验设计

在化学合成培养基B中每次去掉其中一种物质得到单一成分缺失培养基，并培养菌种。若缺失培养基上菌种生长良好，则该物质并不是必须营养，反之则为必须营养素。利用分光光度法，以未加入β-胡萝卜素储备液的粗酶液作为空白对照。在光程为1 cm的玻璃比色皿中加入3 mL的粗酶液（提前在37 ℃的水浴中保温），并加入0.2 mLβ-胡萝卜素储备液，在规定时间内测定460 nm的吸光值，前20 min每隔4 min测定一次吸光值，随后每隔5 min测定一次吸光值，测定55 min内β-胡萝卜素的降解量。在单一成分缺失（氨基酸，无机盐）培养基中，研究β-胡萝卜素的降解效果，判断该缺失成分为必需营养素、半必需营养素还是非必需营养素。以上所有试验重复3次，每次3个平行，结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 天然培养基和合成培养基上的菌种培养

由图1可以看出，合成培养基与天然培养液菌体生长状况基本一致，都适合该菌的生长，且12 h菌体最为丰富，试验时取12 h菌液离心得粗酶。

2.2 合成培养基中氨基酸的筛选

合成培养基中的氨基酸分为酸性氨基酸（谷氨酸，天冬氨酸），碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸），芳香族脂肪酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸），含羟基或巯基或亚氨基的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸），脂肪族氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸），在缺失不同氨基酸与完全合成培养基的条件下得到粗酶液，粗酶液降解胡萝卜素情况如图2所示。图2是在缺失酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）与完全合成培养基的条件下粗酶液的降解曲线。

由图2可以看出，缺失谷氨酸和天冬氨酸的粗酶液对β-胡萝卜素的降解与完全培养基中获得的粗酶液差异很小。因此，可以推断化学合成培养基中添加谷氨酸和天冬氨酸菌的生长以及产生β-胡萝卜素酶没有直接的关系，所以谷氨酸和天冬氨酸是非必需的氨基酸。

图3是在缺失碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）与完全合成培养基的条件下粗酶液的降解曲线。从图3可以看出缺失精氨酸的粗酶液几乎没有降解β-胡萝卜素的能力，从而可以很容易得到精氨酸是菌体生长所必需的氨基酸；缺失组氨酸、赖氨酸的粗酶液降解β-胡萝卜素的能力虽然在前20 min不及完全合成培养基，但是随着时间的延长，降解效果和完全培养基没有明显差异，所以这两种氨基酸对菌的生长以及降解酶的产生也没有太大的作用。

图4是在缺失芳香氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）与完全合成培养基的条件下粗酶液的降解曲线。由图4得知缺失色氨酸的粗酶液几乎没有降解β-胡萝卜素的能力，即色氨酸是必需营养素；而缺失酪氨酸的粗酶液能够降解β-胡萝卜素，但是降解的速度较慢；缺失苯丙氨酸的培养基的粗酶液的降解率和完全合成培养基的很相近。

图5是在缺失含羟基或巯基或亚氨基的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸）与完全合成培养基的条件下菌株的生长曲线，由图5可以得出缺失苏氨酸和胱氨酸，脯氨酸粗酶液对胡萝卜素降解能力很弱；而蛋氨酸和丝氨酸的缺失同完全合成培养基降解情况相似。

图6是在缺失脂肪族类（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸）与完全合成培养基的条件下菌株的生长曲线。由图6可以看出，缺失亮氨酸的粗酶液能够降解β-胡萝卜素，但是其降解速度与完全合成培养基相比较慢；缺失结氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸对粗酶液会产生一定的影响，但是影响不是很大。

在不同氨基酸缺失的条件下根据胡萝卜素降解情况确定了氨基酸的种类，结果如表2所示。

根据胡萝卜素降解情况确定了必需氨基酸是Arg、Leu、Trp、Thr、Cys、Pro，半必须氨基酸是Tyr，这为培养基的进一步优化奠定了基础。

2.3 合成培养基中无机盐的筛选

在确定氨基酸的种类后，有必要对无机盐进行筛选，本实验对合成培养基中的MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、NaNO3、K2HPO4共5种无机盐进行试验，结果如图7所示。

由图7可以看出，缺失NaNO3和K2HPO4的粗酶液降解β-胡萝卜素的能力很差，几乎没有降解；而缺失MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和KCl的粗酶液的酶活也都有所降低。说明NaNO3和K2HPO4是合成培养基中必需的无机盐，对培养基的影响较大，其他无机盐影响相对较小。

3 结论与讨论

通过试验发现在该降解β胡萝卜素的葡萄球菌化学培养基中，必需氨基酸为精氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸；半必需氨基酸为酪氨酸；非必需氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸。必需无机盐为NaNO3和K2HPO4。MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和KCl也影响β胡萝卜的降解情况，在培养基中是不可以缺失的成分。

该试验确定了β-胡萝卜素降解菌必需营养需求，试验结果为后续相关机理的研究奠定了基础。但是目前在只含必需成分的培养基中菌种生长并不理想，这可能与氨基酸之间的相互作用有关，还需进一步试验。

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该试验确定了β-胡萝卜素降解菌必需营养需求，试验结果为后续相关机理的研究奠定了基础。但是目前在只含必需成分的培养基中菌种生长并不理想，这可能与氨基酸之间的相互作用有关，还需进一步试验。

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