甘肃地区猪发酵床土著菌种安全性评价

丁文姣，李晓蓉，董 俊

（甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃 兰州 730070）

土著菌种发酵床养猪技术利用周围自然环境的生物资源，即采集本地土壤中的多种有益微生物，通过对这些微生物进行培养、扩繁，形成有相当活力的微生物母种，再合成菌剂用于发酵床养猪，菌剂的安全及可靠是其进行推广的基础与前提。为此，我们对前期分离筛选的土著菌种进行了安全性检验，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌种为2010年7月至2011年4月从兰州、武威、临洮3地采集不同种类样品的分离所得（见表1）和活力99生酵剂（市售）。供试培养基为马铃薯蔗糖琼脂（PSA），肉汁胨琼脂（BPA），肉汁胨培养液。供试小白鼠为昆明系小白鼠，标准体重20 g左右，共100只，雌雄各半，购于兰州大学。

表1 供试标样来源

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离及纯化 在超净工作台用灭菌器械挑取标样1 g左右于灭菌锥形瓶内，用无菌水定容到100 mL，震荡20 min后静置5 min，然后将其稀释到质量浓度为10-8g/mL，分别在10-4、10-6、10-8g/mL浓度下各取0.5 mL悬液平铺于PSA平板上；再将10-2、10-4、10-6g/mL 3个浓度悬液80℃恒温水浴处理30 min后各取0.5 mL平铺于BPA平板上，每处理5个平板，37℃黑暗条件下培养24 h。取出培养好的平板，统计每个标样所分离出菌种的类型计数，并挑取长势良好的菌种划线接入BPA培养基纯化培养，在PSA平板上培养闻味初筛，挑取气味不刺鼻的单菌落作为备选菌种保存备用。

1.2.2 菌种安全性毒力试验 将备选菌种活化至PSA，置于37℃恒温培养箱培养。将活化好的菌种接种至肉汁胨培养液，37℃恒温条件下摇床培养48 h，取培养好的菌液于血球计数板计数，计算1 mL菌液的活菌数。试验设菌种接种为主处理（A），共9个，处理A1为用菌种JZ1接种2次，处理A2为用菌种JZ2接种2次，处理A3为用菌种JZ3接种2次，处理A4为用菌种JZ4接种2次，处理A5为用菌种JZ5接种2次，处理A6为用菌种JZ6接种2次，处理A7为用菌种JZ7接种2次，处理A8为用菌种JZ8接种2次（活力99生酵剂，菌种对照），处理⑨为不接种，空白对照。设接种处理方式和接种菌液量为副处理（B），共3个，处理B1为灌胃0.25 mL/只，处理B2为灌胃0.50 mL/只，处理B3为腹腔注射0.50 mL/只。每处理取6只小鼠（雌雄各3只），先用菌液浓度为5×108个/mL的菌种接种1次，饲养观察14 d后再用菌液浓度为50×108个/mL的菌种接种1次，饲养观察14 d。试验前1 d给小鼠断食断水，接种处理好的小鼠1 h后正常喂食饮水，在20℃恒温条件下饲养观察。

表2 代表性菌种及来源

2 结果与分析

2.1 菌种分离纯化结果

通过对采集自兰州、武威、临洮3地不同样源类型的19个样品标本经分离、纯化，共获得纯化菌种167株。

2.2 菌种安全性评价

根据对功能菌的样源地、样品类型、产酶特点、生长状况的综合分析，选取前期试验中获得的具有代表性的土著功能菌种7株和商品菌种作为菌种对照布置毒力试验，代表性菌种及来源见表2。

试验结果（表3）表明，从菌种接种方面可以看出，第1次接种后饲养观察14 d，各处理对小鼠采食状况、饮水、行为能力以及体貌特征如毛况等均无影响，小白鼠均未出现死亡。第2次接种后饲养观察14 d，各处理的小白鼠也均未出现死亡，采食和精神状态良好。接种2次后各处理小白鼠的生长情况同接种前。试验结束后剖解观察小白鼠各脏器（如心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胃、肠、气管、生殖器官等部位）均无病变且无出血点，表明所选7个土著菌种安全无毒。进一步将这些菌种对实验动物小白鼠经口灌胃法、腹腔注射法进行毒力试验的结果表明，不同菌液用量灌胃处理和腹腔注射处理的小白鼠均未出现死亡，且采食状况、行为能力以及精神状态均无异常。综合以上结果，试验评价的7株土著功能菌种均安全可靠，可以用于猪发酵床制作接种并作为合成菌剂的备选菌种。

表3 选取菌种安全性试验

3 小结与讨论

1）试验筛选出的7个土著菌种菌株均为甘肃地区土著功能菌种。试验结果表明，不同菌液用量灌胃处理和腹腔注射处理的小白鼠均未出现死亡，且小白鼠采食状况、行为能力以及精神状态均无异常，即7株土著功能菌种均安全可靠，可以用于猪发酵床制作接种并作为合成菌剂的备选菌种，但今后尚需进一步扩大实验动物数量，继续进行长期的安全性评价。

2）发酵床养猪技术自近年传入我国后，目前不分南北都有采用，商业公司宣传为“生物环保养猪法”。但实际生产中存在许多客观问题，因此，对合成菌剂的菌种在菌剂合成之前进行安全性风险评估，建立适合我国国情的菌种安全性评价体系，对保证发酵床养殖的安全性有重要的意义。