镇肝熄风汤预处理对大脑中动脉梗死大鼠脑组织ET－1表达、TNF－α含量及髓过氧化酶活性的影响

吴艳霞，吴婷玉，叶红，付雷 （武汉第一医院，.老年病科，.中心实验室，湖北 武汉4300）

缺血性脑卒中发生后，局部急性缺血会刺激ET－1大量表达，而ET－1的过度表达可引起脑组织缺血区 域 局 部（tumornecrosis factor alpha，TNFα）、细 胞 黏 附 分 子－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）及白介素8（interleukin－8，IL－8）水平增加，并导致局部单核细胞浸润［1－2］，局部炎症反应和及激活相关细胞因子信号通路使血脑屏障受损，介导大量神经元死亡，加重脑水肿及脑组织损伤程度。既往研究显示镇肝熄风汤可显著降低脑出血大鼠血浆和脑组织中ET 含量，缓解脑水肿症状［3］。在前期研究中，我们发现镇肝熄风汤具有降低原发性高血压大鼠脑组织中ET－1分泌［4］。本实验在前期研究的基础上，进一步观察了镇肝熄风汤干预大脑中 动 脉 梗 死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠后，对脑组织ET－1 及TNF－α表达以及髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的影响。从缺血局部炎症反应角度，分析和探讨了镇肝熄风汤对缺血部位单核细胞活性的调节，以及改善局灶性脑缺血组织病理学变化、减轻局部脑水肿的可能机制。

1 材料

TRIzol（GIBCO BRL），M－MLV Reverse Transcriptase、Taq 酶（Promega），QuantiTect SYBR Green RT－PCR Kit（Qiagen Ltd），TNF－α 定 量ELISA 试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；髓过氧化物酶检测试剂盒（南京生物建成有限公司）；ET－1 免疫组织化学检测试剂盒（博士德，批号20101121）。

2 方法

2.1 镇肝熄风汤制备 怀牛膝30g，代赭石30g，生龙骨15g，生牡砺15g，生龟甲15g，生杭芍15g，玄参15g，天冬15g，川楝子6g，生麦芽6g，茵陈6 g，甘草4.5g组成。药物由湖北中医学院中药系提供，代赭石、生龙骨、生牡砺、生龟板先煎2h，然后和其余药物用8倍纯化水常规煎煮3次，过滤，浓缩至生药1.5g·mL－1和3.0g·mL－1，4 ℃储存备用。

2.2 模型制作与分组 清洁级Wistar大鼠120只，体质量260～300g［SCXK（鄂）201130002］。雌雄不限，由华中科技大学实验动物中心提供。模型制作参照Pantoni的线栓法制备MCAO 大鼠模 型［5］。大 鼠 用2%戊 巴 比 妥 钠 麻 醉（40 mg·kg－1），背位固定于大鼠手术台，颈部正中切口2～2.5cm，分离二侧甲状腺，颈上交感神经及位于深层的颈内动脉最下端分支－翼腭动脉并于分支前1 mm 处结扎。在颈外动脉距颈总动脉分支约3mm处剪一小口，插入栓塞线，同时将颈外动脉端牵向外下方，使之与颈内动脉呈平行走向，拉直与颈内动脉的夹角，将栓塞线（日本制尼龙线，直径0.205 mm）缓缓推入至大脑中脑动脉口，与颈外动脉同时结扎以固定栓塞线。近心端用另一根缝线结扎，取下动脉夹，逐层缝合。术中用白炽灯加热，维持大鼠肛温37 ℃左右。假手术（Sham）组除仅分离颈内外动脉，不闭塞大脑中动脉，其余手术步骤同模型组。将实验大鼠随机分组：（1）A 组：假手术组；（2）B组：模型组；（3）C 组：小剂量镇肝熄风汤干预组（15g·kg－1）；（4）D 组：大剂量镇肝熄风汤 干 预 组（30g·kg－1）。其 中C、D 组 大 鼠 于MCAO 术前14天给予不同剂量镇肝熄风汤灌胃，A、B组大鼠给予纯化水灌胃。每100g体质量给1mL，分2次灌服，共14d。

2.3 逆转录反应 收集各组缺血脑组织，用Trizol一步法提取组织总RNA，取1μg组织总RNA ，加入Oligo primer（0.5mg·mL－1）1μL，去离子水12 μL 混匀，70 ℃预热5min。0 ℃冰水浴立刻终止，5 000r·min－1离心4s。加入5×reaction buffer 4 μL Ribonuclease 酶抑制剂（20 U·μL－1）1μL 、dN TPs（10μmol·L－1）2μL 混匀，37 ℃放置5 min，再加Reverse Transcriptase（200 U·μL－1）1 μL，42 ℃下放置60min，再70 ℃预热10min。0℃终止后，cDNA－20 ℃冻存。

2.4 荧 光 定 量 检 测ET－1 的mRNA 表 达 采 用SYBR Green荧光染料法针对ET－1mRNA 进行实时RT－PCR 检测，缓冲液10μL、ddH2O 4μL、ROX荧光染料1μL，预变性95℃10s、94℃20s，56℃15s延伸72℃15s，45次循环，72℃5min。设置阴性对照和β－actin 内参照，引物序列：F 5′－TCTTCTCTCTGCTGTTTGTGGCTT－3′，R 5′－TCTT TTACGCCTTT－CTGCATGGTA－3′。

2.5 免疫组织化学法检测ET－1分布及表达 收集各组缺血脑组织，切除部分端脑组织，置4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后进行切片，采用SABC 法，以PBS 代替一抗作阴性对照。ET－1蛋白检测I抗（兔抗大鼠ET－1）、Ⅱ抗（生物素标记山羊抗兔lgG）。染色步骤按照免疫组化试剂盒说明进行。结果判定：阳性反应为深棕色颗粒，每张切片在400倍显微镜视野下随机选取缺血区5个不重叠视野计数ET－1阳性细胞数。阴性对照，染色时不加入一抗，结果为阴性。

2.6 ELISA 法检测脑组织TNF－α含量 收集各组缺血脑组织，研磨成匀浆，加0.1moL·L－1磷酸盐缓冲液（pH 7.4）至5 mL，离心3 000r·min－1×3 min，取上清液进行检测。采用EL ISA 法检测上清液TNF－α的含量。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.7 分光光度法检测MPO 活性 收集各组缺血脑组织，称取湿重后匀浆并4 ℃离心（12 000×g，10 min），参照Weston等方法［2］及试剂盒说明，采用分光光度法，于460nm 波长检测缺血侧脑组织MPO活性。

3 结果

3.1 镇肝熄风汤对缺血脑组织ET－1的mRNA 水平的影响 各组缺血脑组织ET－1 及空白对照组mRNA 的浓度，经t检验，结果显示模型组（A 组）大鼠缺血侧脑组织ETmRNA 表达量较假手术组（B组）大鼠有极显著的增加（P＜0.01）；大剂量镇肝熄风汤（D 组）预先使用可明显降低MCAO 大鼠缺血侧脑组织ETmRNA 表达量（P＜0.05）。见图1。

3.2 镇肝熄风汤对缺血脑组织ET－1的蛋白水平的影响 免疫组织化学检测结果显示，与假手术组（A 组）相比，MCAO 模型组（B 组）大鼠缺血侧脑组织中ET－1阳性细胞表达显著升高（P＜0.01）；镇肝熄风汤高、低剂量干预组（C、D 组）MCAO 大鼠缺血侧脑组织中ET－1阳性细胞表达下降且与模型组相比差异具有极显著性（P＜0.01）。见图2，表1。

图1 镇肝熄风汤对MCAO 大鼠缺血侧脑组织ET－1mRNA 表达的影响（n＝8，real－time RT－PCR）A：假手术组；B：模型组；C：小剂量镇肝熄风汤组；D：大剂量镇肝熄风汤组（注：与模型组相比，aP＜0.05，b P＜0.01）Fig 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on the expression of ET－1mRNA in MCAO ischemirats rats brain tissue（n＝8，real－time RT－PCR）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group（Note：compared with model group，aP＜0.05，b P＜0.01）

3.3 镇肝熄风汤对缺血脑组织TNF－α 含量及MPO 浓度的的影响 ELISA 检测TNF－α含量结果显示，与假手术组（A 组）相比，MCAO 模型组（B组）大鼠缺血侧脑组织中TNF－α含量显著升高（P＜0.05）；镇肝熄风汤高量干预组（D 组）MCAO 大鼠缺血侧脑组织中TNF－α含量下降且与模型组相比具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 镇肝熄风汤对MCAO 大鼠缺血侧脑组织ET－1蛋白表达的影响（SABC，×400）A：假手术组；B：模型组；C：小剂量镇肝熄风汤组；D：大剂量镇肝熄风汤组Fig 2 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression in MCAO ischemic rats brain tissue（SABC，×400）A.sham operation group；B.model group；C.a small dose of Zhengan Xifeng decoction group；D.large dose of Zhengan Xifeng decoction group

为了评价大鼠MCAO 后缺血侧脑组织中单核细胞的活化程度，我们检测了MPO 的浓度，作为判断单核细胞活化程度的指标。结果显示假手术组（A 组）脑组 织 中MPO 浓 度 很 低，模 型 组（B 组）缺血侧脑组织中MPO 的浓度较假手术组显著升高（P＜0.01），而不同剂量镇肝熄风汤干预组（C、D 组）MPO 浓度较模型组均有明显降低（P＜0.05），其中又以大剂量镇肝熄风汤干预组MPO 浓度降低最为显著（P＜0.01），见表1。

表1 镇肝熄风汤对MCAO 大鼠缺血脑组织ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 浓度的影响（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

表1 镇肝熄风汤对MCAO 大鼠缺血脑组织ET－1 蛋白TNF－α含量及MPO 浓度的影响（±s，n＝8）Tab 1 Effect of Zhengan Xifeng decoction on ET－1protein expression，TNF－αcontent and MPO concentration in MCAO ischemic rat brain tissue（±s，n＝8）

注：与模型组相比，aP＜0.05，b P＜0.01

4 讨论

ET 主要由血管内皮细胞合成分泌，是目前已知最强的缩血管物质，在神经系统有广泛的分布，脑内ET 主要分布于下丘脑、大脑皮质、纹状体和侧脑室等组织［6－7］。生理状态下，低浓度的ET－1可选择性地激动ETB受体，使脑血管扩张，参与脑部血流的调节；在脑缺血发生极早期，局部组织ET－1高度表达是机体调节局部血液供应的重要病理生理机制，但是，局部高浓度的ET－1可通过激动ETA受体使脑血管产生强烈、长时间的收缩，加重局部缺血反应，使用ETA受体抑制剂后可明显减少脑缺血后的神经元损伤［6，8］。本实验结果显示，与假手术组相比，MCAO 模型组大鼠在脑缺血6h后，缺血侧脑组织中ET－1mRNA 及其蛋白质表达有显著性升高，并与脑梗死面积和脑水肿程度呈正比，这与Barone等［9］研究结果一致，而镇肝熄风汤高、低剂量干预组MCAO 大鼠缺血侧脑组织中ET－1表达量均有不同程度下降，且镇肝熄风汤对ET－1表达的抑制是从转录水平上进行的。

据报道，脑缺血急性期缺血区域组织缺血、缺氧及细胞坏死，一方面可直接激活局部炎症反应，另一方面急性缺血引起的ET－1高度表达可通过激活炎性细胞因子TNF－α介导中性粒细胞而参与局部炎症反应，从而使血脑屏障受损，加剧了脑缺血性损害及脑水肿［10］。在本次实验中，我们发现与Juergens等［10］研究结果类似，在脑局部缺血6h 后，MCAO模型组大鼠脑组织TNF－α含量及单核细胞的活化程度，伴随着脑组织ET－1表达量的增加而增加，而预先使用镇肝熄风汤14d后，发生局部脑缺血大鼠脑组织中TNF－α含量及单核细胞活化程度与模型组相比显著降低。由于ET－1在脑缺血发生极早期的高度表达可过度激活TNF－α分泌并募集、活化局部中性粒细胞，而镇肝熄风汤具有明显的抑制ET－1表达的作用，因此，抑制ET－1高度表达引起的局部炎症反应可能是镇肝熄风汤发挥对脑梗死的防治作用的主要分子机制。

就临床而言，缺血性脑卒中病理性质多属本虚标实，肝肾阴虚、气血衰少为致病之本，风、火、痰、气、淤为发病之标。现代中医证候研究发现，证候是疾病发生发展过程中不同阶段的机体整体反应，是一个动态演变过程，在缺血性脑卒中的急性期、慢性期或恢复期等阶段均存在不同主要证候［11］，临床研究发现，火证、淤证和痰证可能是中风急性期主要改变［12］，而中风之火证、淤证和痰证等又与病理状态下人体免疫系统及凝血系统等异常反应密切相关。急性局部脑缺血时过度的ET－1、TNF－α等类炎性／炎性细胞因子表达，局部活化的炎症反应及出、凝血反应等可能均属于中医淤、痰证范畴。镇肝熄风汤具有“重在镇逆，治本图缓、刚柔相济”的特点，张锡纯在立方时即已认识到中风急性发作时肝阳上亢、肝风内动与气血上逆互为因果，治宜平肝潜降，引气血下行，兼顾滋润肝肾。现代临床及实验研究亦显示其具有调节血脂［13］，改善绝经后动脉粥样硬化患者血管内皮功能［14］等功能作用。因此，通过预防性使用镇肝熄风汤可以调节机体在应激环境下的反应状态，抑制缺血性脑卒中急性发作时淤、痰等病理产物的产生，从而达到改善缺血性脑卒中急性期组织损伤的作用。

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