正交设计法优选赤雹根中总皂苷成分的提取工艺

赵春颖，苗光新，刘永平，佟继铭，毛晓霞 （承德医学院中药研究所－河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德067000）

赤雹（Thladiantha dubia Bunge，TDB）为葫芦科多年生蔓性草本植物，赤雹根是赤雹的干燥成熟块根，为满族民间长期沿用的药材，多为民间自种备用，赤雹根味苦性寒、活血祛淤、清热解毒、且具通乳作用；主要用于治疗跌打损伤、关节肿痛、行经腹痛、瘰疬、痈肿及产后血淤、乳汁不通等症［1］，疗效显著，且未见明显不良反应。本课题组经研究发现赤雹根水提物具有明显的抗炎、镇痛作用［2－3］，同时观察到不同浓度赤雹根水提取物对人白血病细胞K562的增殖有剂量依赖性的抑制作用［4］。因此，本课题组对赤雹根的化学成分进行了系统研究发现赤雹根主要成分为皂苷、多糖、挥发油、有机酸等［5］，而且发现皂苷为其主要成分。本文从应用基础出发，通过单因素实验和正交试验设计，优选出赤雹根中总皂苷的最佳提取工艺，为其进一步活性研究提供基础依据。

1 材料

1.1 药材 赤雹根于2008年10月采自河北省青龙满族自治县，由承德医学院赵春颖副研究员鉴定为 葫 芦 科 植 物 赤 雹（Thladiantha Dubia Bunge，TDB）的干燥成熟块根，块根采收后切片晒干为饮片，样品保存于承德医学院中药研究所。

1.2 仪器 Agilent1200 型四元泵高效液相色谱仪，HumanPDWER2型超纯水处理器；紫外－可见分光光度计（UV 8453 Agilent）；高速万能粉碎机（FW80型），旋转蒸发仪（RE－52AA）；离心机（长沙湘仪仪器有限公司）；微孔滤膜（0.45μm，北京康林公司）。

1.3 试剂 对照品齐墩果酸（中国食品药品检定研究院，批号1153－200604）；甲醇为色谱纯（天津赛孚瑞科技有限公司）；乙醇、磷酸、硫酸、氯仿等试剂，均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 高效液相色谱法测定赤雹根总皂苷提取物中齐墩果酸含量 色谱条件为：Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm，瑞典Ekachemicals公司）；流动相为甲醇－水－磷酸（95∶5∶0.25，V／V／V，使用前超声脱气）；流速1 mL·min－1，检测波长215 nm；柱温30 ℃，外标法定量分析。

2.2 赤雹根中总皂苷的提取工艺

2.2.1 提取温度的选择 精密称取干燥至恒重的赤雹根粉末10 g，共6份，分别在50，60，70，80，90，100 ℃的水浴中回流提取2 次，每次1 h。结果可见，在80 ℃以下，随着温度的升高，提取率随之上升，提取温度的升高，促进了皂苷的溶出；但当温度达到80℃以后，提取液开始沸腾，温度再上升，提取率却不再提高，提取温度在80 ℃，90 ℃和100 ℃时，皂苷提取率差别不明显，高温能促进赤雹根总皂苷的溶出，同时也可引起提取物的热敏损失和杂质的溶出，因此，提取温度采用80 ℃为宜，见图1。

2.2.2 提取次数的考察 精密称取干燥至恒重的赤雹根粉末10 g，共5份，用8倍量70%乙醇在80℃回流提取，分别提取1，2，3，4，5次，每次1 h，考察提取次数对皂苷提取率的影响。由结果可见，随着提取次数的增加，皂苷提取率呈不断上升的趋势。

图1 提取温度对皂苷提取率的影响Fig 1 Effect of different extraction temperature on extracting ratios of saponins

提取3次时达到较高峰值，随后提取4次和5次皂苷提取率变化不大，随着提取次数的增加，杂质的含量也随之增加，不利于进一步纯化，且考虑到成本，因此确定提取次数为3次，见图2。

图2 提取次数对皂苷提取率的影响Fig 2 Effect of different extraction times on extracting ratios of saponins

2.2.3 乙醇体积分数的选择 精密称取干燥至恒重的赤雹根粉末10 g，共5份，在80℃下，料液比为1∶8，提取溶剂分别为50%，60%，70%，80%，90%乙醇，回流提取3次，每次1 h，结果得总皂苷提取率分别为1.71%，2.98%，3.29%，3.15%，3.19%，由此确定采用70%乙醇提取，皂苷得率最高。

2.2.4 料液比的考察 精密称取干燥至恒重的赤雹根粉末10.0g，共5份，在80℃下，料液比为1∶6，1∶8，1∶10，1∶15，1∶20，70%乙醇回流提取3次，每次1 h，结 果 总 皂 苷 提 取 率 分 别 为2.67%，3.18%，3.22%，3.25%，3.29%，总皂苷提取率随料液比增加缓慢增加，考虑到为了节约溶剂降低成本，由此确定料液比为1∶8最为合适。

2.2.5 提取时间的考察 精密称取干燥至恒重的赤雹根粉末10.0g，共4份，在80℃下，料液比为1∶8的70%乙醇条件下回流提取3次，每次提取时间分别为40 min，1，1.5，2 h，结果总皂苷提取率分别为2.67%，3.09%，3.12%，3.17%，总皂苷提取率随提取时间延长缓慢增加，考虑到为了节省时间，由此确定提取时间为1 h最为合适。

2.2.6 正交试验设计提取赤雹根中总皂苷 称取干燥至恒重的赤雹根粉末9 份（每份10 g，精密称定），分别置于250 mL 具塞三角瓶中进行提取，按照单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比、提取次数、提取时间4个因素为影响总皂苷提取率的主要因素，每个因素选择3个水平，按表1按照正交试验设计进行操作，提取温度选择80 ℃回流提取，提取液浓缩干燥，得干膏，称重，计算提取率。结果和分析见表2、表3。

表1 正交试验设计因素与水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal test design

表2 正交试验分析Tab 2 Analysis of orthogonal test

表3 方差分析表Tab 3 Analysis of variance

方差分析表明，乙醇不同体积分数（A）对赤雹根皂苷提取率具有显著统计性差异（P＜0.05），固液比（B）、提取次数（C）、提取时间（D）对皂苷提取率无显著性影响，影响提取效果因素的大小顺序：A＞B＞C＝D。优化工艺为A2B1C3D1，因此得出赤雹根总皂苷最佳提取工艺为：8 倍量70%乙醇，80 ℃水浴回流提取3次，每次1 h。

2.2.7 最佳工艺的验证 为了验证上述最佳工艺条件的可靠性和稳定性，本实验选取3批号的赤雹根粉末不同投料量进行验证试验。精密称取干燥至恒 重 的 3 个 批 号（2010091102，2010092507，2010101903）的赤雹根粉末100，200，300 g，按照赤雹根总皂苷最佳提取工艺提取总皂苷，称量总皂苷浸膏的质量，计算总皂苷提取率。再称取浸膏0.3 g加10%硫酸200 mL，沸水浴中水解2 h，冷却后过滤，所得滤渣用水洗至中性，45 ℃烘干后加入氯仿，超声20 min，过滤，滤液蒸干后加甲醇溶解，定容100 mL量瓶中，经0.45μm 微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。按照“2.1”项下的色谱条件测定浸膏中齐墩果酸含量，结果见表4。

表4 3个批号的赤雹根最佳提取工艺确认试验结果Tab 4 Results of confirming test of optimum extraction technology of total saponins for three batches of root tuber of Thladiantha dubia

以上试验结果表明，3批次赤雹根药材工艺试验总皂苷浸膏的提取率和浸膏中齐墩果酸含量基本稳定，其中浸膏中齐墩果酸平均含量为45.27 mg·g－1，折合为赤雹根药材中齐墩果酸平均含量为1.69 mg·g－1，与前期报道的赤雹根药材中齐墩果酸含量测定值［6］相吻合，因此验证了经过正交试验优选所得工艺是稳定可靠的。

3 讨论

皂苷是广泛存在于天然植物中的一种具有生物活性的物质，研究表明，植物中的皂苷具有巨大的开发价值和应用前景。赤雹根中的皂苷主要以三萜皂苷为主，三萜类化合物的苷元结构较大，极性低，具有亲脂性，而糖部分极性大，具有亲水性，这种结构类型的中药有效成分较适合采用醇法提取，所以本实验采用乙醇回流法提取赤雹根中的总皂苷。

本实验对供试品溶液和对照品齐墩果酸溶液进行了紫外全波长扫描，发现最大吸收波长均为202.5 nm，但在液相色谱中，由于流动相在短波长处有末端吸收，为了消除背景，提高信噪比，对不同波长的色谱图进行比较，最终确定检测波长为215 nm。目前国内外尚无赤雹根皂苷类成分的法定对照品，而赤雹根中所含的皂苷类成分的苷元主要是齐墩果酸，且两者紫外吸收最大波长基本一致，因此选取齐墩果酸为对照品，计算赤雹根中总皂苷含量。赤雹根中齐墩果酸含量测定方法在前期研究中已经做过相应的报道［6］。

根据单因素实验，在正交试验中选用乙醇体积分数、料液比、提取次数和提取时间4个因素为考察指标，每个因素3个水平，进行了赤雹根总皂苷提取方法考察及对实验结果方差分析，结果均表明4个设定因素对实验结果的影响为：乙醇体积分数＞乙醇用量＞提取次数＝提取时间。结合单因素和正交试验结果获得最佳提取条件为：8倍量体积分数为70%的乙醇，80 ℃回流提取3次，每次1 h。

［1］ 宋立人，红恂，丁绪亮，等.现代中药大辞典.上册［M］.北京：人民卫生出版社，2001∶1022.

［2］ 陈建双，张玉玲，赵波，等.赤雹根总皂苷抗炎作用研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（8）∶163.

［3］ 张玉玲，赵波，陈建双，等.赤雹根镇痛作用及有效部位研究［J］.时珍国医国药，2010，21（10）∶2483.

［4］ 张玉玲，赵波，刘永平，等.赤雹根水提取物对人白血病细胞K562的抑制作用［J］.时珍国医国药，2010，21（2）：397.

［5］ 张玉玲，赵波，刘永平，等.赤雹根化学成分的系统预实验研究［J］.承德医学院报，2009，26（3）：246.

［6］ 赵波，张玉玲，赵春颖，等.RP－HPLC 测定赤雹果中齐墩果酸含量［J］.承德医学院报，2010，27（3）：241.