补料工艺对三孢布拉霉菌合成β-胡萝卜素的影响

宋相波

(浙江医药股份有限公司新昌制药厂 浙江绍兴 312500)

β－胡萝卜素,被FAO和WHO食品添加剂协会一致推荐并认定为A类营养色素,是一种有效的生物抗氧化剂,近年来,它的应用领域从食品着色转向营养食品、保健品、药品及饲料四大领域,市场需求不断增加。

β－胡萝卜素的生产方法有化学合成,植物提取和微生物发酵三种。微生物发酵法生产天然β－胡萝卜素因不受环境条件限制而受到重视,是现在国际上工业化生产β－胡萝卜素的主要研究方向。目前已发现能合成β－胡萝卜素的微生物主要有瑞士乳杆菌、球形红杆菌、短杆菌、分枝杆菌、粘红酵母、布拉克须霉、三孢布拉霉等。尤其三孢布拉霉(Blakeslea trispora)与其他菌种相比具有生物量大,单位菌体量β－胡萝卜素产量高等优点,是工业化生产天然β－胡萝卜素的理想微生物[1]。为进一步提高此菌株的合成能力,本文通过在不同时期添加β－胡萝卜素结构类似物三孢酸、β-紫罗兰酮、巴比妥酸,考察其对合成β－胡萝卜素是否有促进作用[2]。

1 材料与方法

1.1 出发菌株

三孢布拉霉菌“＋”“－”菌株,笔者实验室保藏。

1.2 培养基

斜面培养基:PDA培养基[3](新鲜去皮马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g加水至1000ml,PH自然)。

母瓶培养基:玉米浆6%,葡萄糖2%,玉米粉1%,KH2PO40.005%,VB10.0002%,豆油1%。PH调至6.5

发酵瓶培养基:玉米淀粉2%,黄豆粉2%,玉米浆3%,豆油4%,KH2PO40.005%,VB10.0002%,Mg2SO40.025%。PH调至7.0。

1.3 培养条件

将保藏菌株三孢布拉霉菌“＋“－”菌株分别涂布于PDA斜面,28℃培养3—5天,“＋”“－”菌孢子分别用无菌水洗下。接入装量为160ml的750ml三角瓶中,在温度为28.0℃,摇床转速为230r/min条件下培养48小时。“＋”“－”菌以一定量一定比例接入装量为30ml的250ml三角瓶中,在温度为28.0℃,摇床转速为230r/min条件下培养6天。

1.4 补料方案

A方案:以1.3培养条件进行培养,分别在发酵培养阶段0hr,24hr,48hr添加三孢酸0.01%,0.05%,0.1%,培养结束后检测β－胡萝卜素含量。

B方案:以1.3培养条件进行培养,分别在发酵培养阶段0hr,24hr,48hr添加β-紫罗兰酮0.01%,0.05%,0.1%。培养结束后检测β－胡萝卜素含量。

表1

C方案:以1.3培养条件进行培养,分别在发酵培养阶段0hr,24hr,48hr添加巴比妥酸0.01%,0.05%,0.1%,培养结束后检测β－胡萝卜素含量。

对照方案:按1.3培养条件下进行培养,不进行任何补料。

1.5 检测方法

样品处理后,在波长为455nm可光分光光度计下测得其含量(ug/ml)。

2 结果与分析

对按A,B,C方案及对照方案培养的最终产物含量检测结果(单位ug/ml)如表1。

从结果分析,在培养开始就加入结构类似物三孢酸、β-紫罗兰酮、巴比妥酸,反而减少了最终产物β－胡萝卜素的合成,原因在于初期加入类似物质,对菌丝生长存在一定的毒副作用,降低了的生长菌丝的质量,从而影响了初级代谢[4]。24hr补料及48hr补料对最终产物的合成基本都有促进的作用(除24hr添加0.1%β-紫罗兰酮和24hr添加0.1%巴比妥酸外),原因可能为24hr以后,菌丝已经达到一定浓度,且已向初级代谢转化,添加类似物质提高了产物合成中多功能氧化酶的活性,使初级代谢提前加速。而在同浓度下,24hr补料产物合成量明显比48小时补料的要高很多,主要原因由于48hr时,菌体自身产生的氧化酶活性已经使产物β－胡萝卜素的转化接近饱和,添加类似物质提高氧化酶活性的作用已减弱,促进产物合成的作用已不再明显。

在菌丝生长到一定程度后,三种物质一定比例的补料对β－胡萝卜素的合成都具有促进作用,但其中尤以巴比妥酸补料的效果最为明显。作为β－胡萝卜素的结构类似物,巴比妥酸不仅能提高产物合成中多功能氧化酶的活性,可能还作为一种底物,直接参与了β－胡萝卜素的合成,从而增加了最终产物量。但过度添加巴比妥酸反而呈现负反馈作用,从结果上分析,巴比妥酸添加比例应小于0.05%.

3 结语

通过对三孢布拉霉菌发酵培养过程中不同时期,不同比例的补料结果分析,补充类似物质对三孢布拉霉菌合成β－胡萝卜素是有具有促进作用的,但补料时间应选在菌丝已生长到一定程度后,初级代谢启动初期。类似物中以巴比妥酸的补料效果最佳,在发酵培养24hr,添加0.01%的巴比妥酸,使最终产物的含量比普通培养高出19.5%.

[1]工业微生物,2002;32(4):7～10.

[2]王见冬,袁其朋,钱忠明.β－胡萝卜素发酵过程中关键的代谢产物—三孢酸* 微生物学通报,2004年31(3):147～150.

[3]食品与发酵为业,2003;29(7):69～74.

[4] 白秀峰.微生物药物工艺学讲义,102～106.