地塞米松对气压创伤性中耳炎模型大鼠中耳黏膜上皮钠通道mRNA 转录的影响

宗雨 李祥翠 张奕 李吉平

糖皮质激素可用于治疗分泌性中耳炎（OME），而长期使用糖皮质激素的副作用较多，故临床上尚存在争议，但是短期局部使用糖皮质激素可以加速中耳腔内积液的吸收，有助于治疗分泌性中耳炎、气压伤性中耳炎等以中耳积液为主要特征的中耳病变。既往有研究表明糖皮质激素可以提高沙鼠中耳黏膜上皮细胞中的钠离子转运［1，2］。地塞米松能诱导上皮钠通道（epithelial sodium channel，ENaC）mRNA（ENaC－mRNA）表达和增加ENaC 摄取Na＋的能力［3］。在人ENaC－α的基因序列中发现有糖皮质激素反应元件的结合位点，推测糖皮质激素调节上皮细胞钠水转运功能的作用是通过直接上调ENaC的转录水平实现［4］，但是糖皮质激素对中耳黏膜上皮细胞中ENaC的作用尚不清楚。本研究拟采用实时定量－聚合酶链反应（real time－polymerase chain reaction，RT－PCR）来评估地塞米松对气压创伤性中耳炎模型动物中耳黏膜ENaC基因转录的影响，为进一步探讨糖皮质激素治疗OME的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生5～7周的清洁级健康SD 雄性大鼠18只，体重140～250克，无噪声暴露和药物使用史，耳廓反射灵敏，外耳道及鼓膜均无异常，术前ABR、声导抗检查均正常。实验动物随机分为为干预组、模型组及正常对照组，每组6只（12耳）。

1.2 气压创伤性中耳炎动物模型的制作 将模型组及干预组大鼠经戊巴比妥钠（45 mg／kg）腹腔注射麻醉后置于密闭容器内，在50秒内改变密闭容器压力使其高于正常大气压4kPa，维持6 分钟。造模成功的判断标准：①经解剖显微镜通过鼓膜直接观察鼓室内有积液；②听性脑干反应检测反应阈提高。本实验中造模成功率为100%。

1.3 各组大鼠的处理 正常对照组未予任何处理，干预组在造模成功后连续三天腹腔注射地塞米松（2 mg／kg，加入生理盐水0.5ml），模型组不用药。造模后第1、3、7天，分别在戊巴比妥钠（45mg／kg）腹腔注射麻醉后，经解剖显微镜观察各组大鼠的鼓膜征象。干预组和模型组大鼠均在造模后第七天断头处死，取中耳黏膜，正常对照组大鼠直接取中耳黏膜。

1.4 各组大鼠中耳黏膜ENaC转录的检测

1.4.1 总RNA 的抽提 造模后第7天将各组大鼠腹腔注射苯巴比妥钠（70mg／kg）麻醉后，快速断头处死，取出听泡用去RNA 酶处理的器械打开听泡，在解剖显微镜下剥离中耳腔鼓岬，中下鼓室及咽鼓管周围的黏膜，立即放入去RNA 酶处理的离心管中，液氮保存。由于大鼠中耳黏膜量极少，故以1只大鼠两耳的中耳黏膜标本为一份实验样品（n＝6）。应用Trizol法抽提各实验样本总RNA，用琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

1.4.2 RNA 反转录为cDNA 取5μg总RNA＋1μl寡聚脱氧核苷酸［Oligo（dT）20］＋1μl dNTP（10mol／mL），用焦碳酸二乙酯水补足至总体积10 μl；65 ℃变性5min，立即置于冰上至少1min；加入10μl合成互补DNA 反应混合液［（2μl 10×反转录缓冲液、4μl MgCl2（25 mol／L）、2μl DTT（0.1 mol／L）、1μl RNaseOUTTM（40 U／μl）、1μl SuperscriptTMⅢRT（200 U／μl）］，50 ℃50 min 互补DNA 合成；85 ℃50min终止反应；加入1μl E.coliRNA 酶H（2U／μl），37 ℃20min酶解残留的RNA；－20 ℃保存。

1.4.3 RT－PCR 反应 应用RT－PCR 检测三组大鼠中耳黏膜α－ENaC、β－ENaC、γ－ENaC 基因转录的差异：①引物设计见表1；②PCR 反应体系：取100ng 模板互补DNA＋10μl 2×QuantiFast SYBR GREEN PCR Master Mix ＋1μl正向引物（10μmol）＋1μl反向引物（10μmol），用不含RNA酶的水补足至总体积20μl；每个样本互补DNA 的每个基因做3 个复孔；③95 ℃变性3 min；40 个PCR 循环（94 ℃，20秒；59 ℃，20秒；72 ℃，30秒）；72℃延伸5min。PCR 产物与100bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。④将PCR 产物进行10倍梯度稀释：设定PCR 产物浓度为1，分别稀释为1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1×10－9这几个浓度的DNA；将这几个梯度稀释的DNA 模板以及所有的cDNA 样品分别配置RT－PCR 反应体系，置于RT－PCR 反应仪进行反应。反应条件：95 ℃，5 min；40个循环（95 ℃，10秒；59 ℃，15秒；72 ℃，20秒；82.5 ℃（收集荧光），5 秒。扩增反应结束后继续从72 ℃缓慢升温至99 ℃（每5秒升高1 ℃），建立PCR 产物的熔解曲线，以鉴定产物是否单一。各样品的目的基因和管家基因分别进行Real time PCR 反应，绘制标准曲线，通过7300System Software软件的分析，计算出样本中各基因的循环阈值（CT 值）；CT 值经对数拟合作图，得到定量标准曲线。根据E＝10（－1／slope）计算扩增效率，采用管家基因GAPDH（不同样品间的表达量基本恒定）作为内参来校正，正常对照组大鼠的正常中耳黏膜作为对照，即以正常对照组所得的数据为1作为参考，待测样品基因相对含量＝2－△△CT（△CT＝待测基因CT－管家基因CT）。

表1 Real time－PCR 引物序列

1.5 统计学方法 采用SPSSl7.0 软件进行统计学处理，所有数据用（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠鼓膜形态 正常对照组大鼠两耳鼓膜各时间段均未见明显异常；模型组第1天时每只大鼠至少有一耳可见鼓室内充满琥珀色积液，鼓膜充血，松弛部膨出，可见小气泡；第3天时鼓室仍有琥珀色积液，以上鼓室为著，松弛部内陷，气泡消失；第7天时未见鼓室积液，鼓膜亦基本恢复正常。干预组第1天时每只大鼠至少有一耳可见鼓室内充满琥珀色积液，鼓膜充血，松弛部膨出，可见小气泡；第3天时所有大鼠两耳均未见明显积液征，鼓膜浑浊；第7天时未见鼓室积液，鼓膜亦基本恢复正常。

2.2 各组大鼠中耳黏膜上皮钠通道mRNA 的表达 干预组与模型组α－ENaC 基因转录相对于正常中耳黏膜分别为1.104 8±0.004 8、0.541 8±0.001 3，干预组相对于模型组上调2.04 倍（P＜0.01）；干预组与模型组β－ENaC 基因转录相对于正常中耳黏膜分别为1.046 0±0.004 3、0.429 9±0.000 9，干预组相对于模型组转录增加2.56倍（P＜0.01）；干预组与模型组γ－ENaC 基因转录相对于正常中耳黏膜分别为1.022 1±0.001 4、0.510 7±0.000 6，干预组相对于模型组转录增加2.00倍（P＜0.01）（图1）。

图1 模型组与干预组中耳黏膜上皮钠通道mRNA 表达干预组的α－ENaC－mRNA、β－ENaC－mRNA、γ－ENaCmRNA 表达明显上调，分别为模型组的2.04、2.56、2.00倍

3 讨论

体外研究［5～8］表明正常中耳黏膜上皮细胞存在ENaC 表达且在积液吸收中起着主导作用，ENaC是贯穿于细胞膜两侧的大分子物质，其启闭直接影响细胞膜两侧的钠离子浓度。已有研究表明ENaC分布在各级呼吸道（从鼻咽到细支气管）上皮细胞的腔顶面［9］。在正常状态下，ENaC 和Na＋－K＋－ATPase共同调节Na＋进出细胞，上皮细胞通过ENaC 摄取Na＋，然后经基底侧表面的Na＋－K＋－ATPase将Na＋泵至组织间隙，在Na＋转运的同时，伴随着水的被动吸收，从而维持细胞内外的Na＋浓度和液体平衡［10］。Song等［11］进一步应用共聚焦显微镜对比人与猪的呼吸道上皮表面液体（粘液毯）（airway surface liquid ，ASL）厚度，发现ENaC 在呼吸道黏膜的Na＋和水吸收中起着重要作用。

中耳腔－咽鼓管黏膜纤毛系统的上皮细胞来源于呼吸道黏膜上皮细胞，如同呼吸道上皮细胞一样，中耳纤毛在其覆盖的黏液毯中运动，通过纤毛的摆动，将中耳腔内的积液通过咽鼓管排至鼻咽部，其电解质、水分的成分及量的恒定在维持中耳黏膜的相对干燥状态中起重要作用［12］。Choi等［13］通过比较体外培养的中耳黏膜上皮细胞与鼻黏膜上皮细胞阿米洛利（amiloride）－敏感的短路循环电流（amiloride－sensitive Isc）、液体吸收能力、ENaC 的基因转录及其蛋白质的表达，发现中耳黏膜上皮细胞的amiloride－敏感的短路循环电流及细胞对液体的吸收能力显著高于鼻黏膜上皮细胞，且其ENaC 的基因转录及其蛋白质的表达一致上调，进一步从分子水平证实中耳黏膜上皮细胞的离子转运在中耳积液清除中起着重要的作用。前期研究［14，15］报道了大鼠的中耳黏膜能够通过ENaC介导钠、水转运，证实了ENaC介导的液体吸收在维护中耳腔的水钠平衡中起重要作用。

目前认为糖皮质激素清除中耳腔积液的机制有以下几种：①通过抑制炎症因子的合成发挥直接抗炎作用；②减轻咽鼓管咽口处黏膜的肿胀，提高咽鼓管的功能；③增加咽鼓管的表面活性物质的产生；④降低粘蛋白的生成，从而降低中耳腔积液的粘度。但近来研究发现，糖皮质激素在调节上皮细胞钠水转运中起重要作用。Tan等［1，2］研究表明ENaC 在中耳腔积液的吸收中起重要作用，且地塞米松能提高沙鼠中耳上皮细胞钠离子的吸收［1，2］；Son等［7］研究认为地塞米松可通过上调人正常中耳黏膜上皮细胞中ENaC－α、β亚基的表达来增加ENaC介导钠、水吸收，从而清除中耳腔积液。本研究结果显示，地塞米松能加速气压创伤性中耳炎SD 模型大鼠中耳腔积液的清除，上调ENaC 在中耳黏膜中的基因转录，使ENaC 的α－mRNA、β－mRNA、γ－mRNA的表达显著上调，分别是模型组的2.04 倍、2.56倍、2.00倍，与Dagenais等［3］的研究一致，该研究发现地塞米松可上调α－ENaC、β－ENaC、γ－ENaC的基因转录，尤以α－ENaC较为显著。另有研究发现在牛乳腺细胞中，地塞米松可以通过上调β－ENaC，γ－ENaC 基因及蛋白的表达来降低乳液中钠离子浓度，该研究认为地塞米松是通过上调糖皮质激素受体的表达来调控β－ENaC、γ－ENaC的转录及表达［16］。所以地塞米松对不同组织细胞中ENaC基因转录的影响可能受个体细胞株的特性以及局部微环境的影响，其具体机制尚不清楚，其分子生物基础以及调控机制有待进一步的研究。

1 Tan CT，Escoubet B，Van den Abbeele T，et al.Modulation of middle ear epithelial function by steroids：clinical relevance［J］.Acta Otolaryngol，1997，117：284.

2 Herman P，Tan CT，Abbeele TV，et al.Glucocorticosteroids increase sodiumtransport in middle ear epithelium［J］.Am J Physiol Cell Physiol，1997，272：184.

3 Dagenais A，Denis C，Vives MF，et al.Modulation of alph－ENaC and alpha1－Na－K－ATPase by cAMP and dexamethasone alveolar epithelial cells［J］.Am J Physiol，2001，281：217.

4 Matalon SO＇Brodovich H.Sodium channels in alveolar epithelial cells：molecular characterization，biophysical properties，and physiological significance［J］.Annu Rev Physiol，1999，61：627.

5 Choi JY，Son EJ，Kim JL，et al.ENaC－and CFTR－dependent ion and fluid transport in human middle ear epithelial cells［J］.Hear Res，2006，211：26.

6 Choi JY，Choi YS，Kim SJ，et al.Interleukin－1beta suppresses epithelial sodium channel beta－subunit expression and ENaC－dependent fluid absorption in human middle ear epithelial cells［J］.Eur J Pharmacol，2007，567：19.

7 Son EJ，Kim SH，Park HY，et al.Activation of epithelial sodium channel in human middle ear epithelial cells by dexamethasone［J］.Eur J Pharmacol，2009，602：383.

8 Portier F，Van den Abbeele T，Lecain E，et al.Oxygen modulates Na＋absorption in middle ear epithelium［J］.Am J Physiol，1999，276：C312.

9 Rochelle LG，Li DC，Ye H，et al.Distribution of ion transport mRNAs throughout murine nose and lung［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279：14.

10 Chambers LA，Rollins BM，Tarran R.Liquid movement across the surface epithelium of large airways［J］.Respir Physiol Neurobiol，2007，159：256.

11 Song Y，Namkung W，Nielson DW，et al.Airway surface liquid depth measured in ex vivo fragments of pig and human trachea：dependence on Na＋and Cl－channel function［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297：L1 131.

12 Portier F，Kania R，Planès C，et al.Enhanced sodium absorption in middle ear epithelial cells cultured at air－liquid interface［J］.Acta Otolaryngol，2005，125，16.

13 Choi JY，Son EJ，Kim JL，et al.ENaC－and CFTR－dependention and fluid transport in human middle ear epithelial cells［J］.Hear Res，2006，211：26.

14 Li JP，Kania R，Eric L，et al.In vivo demonstration of the absorptive function of the middle ear epithelium［J］.Hearing Research，2005，210：1.

15 李吉平，金晓杰，王家东，等.钠离子浓度变化对大鼠中耳液体吸收功能影响的研究［J］.听力学及言语疾病杂志，2008，16：411.

16 Quesnell RR，Han X，Schultz BD.Glucocorticoids stimulate ENaC upregulation in bovine mammary epithelium［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292：C1 739.