不同剂量放射线对小鼠畸变产物耳声发射和外毛细胞Prestin蛋白表达的影响△

赵向东 梁勇 任陈 袁亚维

感音神经性听力损失（sensorineural hearing loss，SNHL）是鼻咽癌患者放疗后常见的并发症之一，严重影响患者的生活质量和社会活动能力。国外文献［1，2］报道放疗后SNHL 的发生率达30%～50%，其发病机理目前仍不明确，多数学者认为放疗导致SNHL 可能与放射线损伤了耳蜗外毛细胞的结构和功能有关［3］。

2000年Zheng等［4］发现了沙鼠耳蜗外毛细胞膜上的一种马达蛋白，并命名为Prestin。Prestin蛋白是外毛细胞膜上马达蛋白复合体的关键组成部分，能够调节细胞膜上带电离子的转运［5，6］，对于哺乳动物听觉高度的灵敏性和频率选择性至关重要［7～9］，Zheng等［10］敲除小鼠的Prestin基因后发现外毛细胞的电能动性降低，听阈上升约50dB，对声音频率的选择性下降，毛细胞胞体长度比正常小鼠的变短且外毛细胞在逐渐死亡［11，12］。哺乳动物的听觉依赖于耳蜗外毛细胞的高频分辨率和信号放大作用，Prestin蛋白是外毛细胞膜的重要组成部分，为了解放射线照射导致的SNHL与Prestin蛋白之间的关系，本实验就不同剂量放射线照射对Balb／c小鼠畸变产物耳声发射和耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达的影响作了初步研究，并进一步探讨放射线照射导致SNHL的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用正常出生后4周龄的雄性Balb／c小鼠48只（由南方医科大学实验动物中心提供），体重17～22g，均排除外耳道及中耳感染并通过DPOAE检测，随机分成4组，每组12只（耳）：正常对照组（不予放射线照射组）、第1组（8Gy放射线照射组）、第2组（12Gy放射线照射组）和第3组（16 Gy放射线照射组）。

1.2 实验方法

1.2.1 各照射组耳部放射线照射方法 小鼠称重，2%戊巴比妥钠溶液按0.3ml／100g的剂量行腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，在X 线下定位，确定内耳照射区域，然后于相同体位固定在直线加速器治疗床上，美国Varian2100直线加速器6MeV 电子线、剂量率为400cGy／min、源皮距100cm，用铅档块避免呼吸道、消化道受照，参考深度为皮下1.5cm，分别给予3个照射组小鼠右侧内耳单次8、12、16Gy剂量放射线照射，对照组不予放射线照射。

1.2.2 DPOAE 检测 放射线照射后第7 天对各组小鼠分别进行DPOAE检测。将被检测小鼠置于隔声室中，用2%戊巴比妥钠溶液0.3ml／100g腹腔注射麻醉，水温40 ℃热水袋保温。用美国GSI型听力计进行测试，两个初始音强度皆为80dB SPL，两者频率之比为f1／f2=1.22，测试频率范围为3～12kHz，即分别测试3、4、6、8、10、12kHz 6个频率，读取2f1－f2处的强度。反应幅值以高于本底噪声3dB为标准记录并计算。

1.2.3 Western Blot分析Prestin蛋白的表达 放射线照射第7天，各组每2只小鼠右侧耳蜗作为一个样本，每组共6个样本，研磨成粉末后加入200μl的RIPA 组织裂解液，匀浆，离心并取上清液。各组取总蛋白200μl经10%SDS—PAGE 凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜，然后用20 ml含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液4 ℃封闭18小时，洗膜后，加入羊抗鼠Prestin 多克隆抗体（1：200），经兔抗羊IgG（1：3 000）二抗（美国Santa Cruz公司）杂交，最后在暗室内加入ECL 化学发光底物，曝光，依次放入显影液和定影液。选用β－actin 作为内参照，并用凝胶成像系统软件SC805凝胶成像系统软件进行分析结果。各组中Prestin蛋白与β－actin 吸光度的比值与正常组比较，判断其表达变化。

1.2.4 荧光实时定量PCR 检测Prestin mRNA 的表达 从GenBank数据库中查找出小鼠Prestin基因序列.使用Primer 5.0软件设计小鼠Prestin引物、探针，内参β－actin引物及探针序列由广州美津生物技术有限公司提供（表1）。小鼠耳蜗剥离后，立即放入液氮中，随后转入－80 ℃保存待匀浆，样本收集完后用Biozol法分别抽提总RNA。各组中分别取1μg总RNA 电泳，检测RNA 质量；随后取RNA 1μg，按照ReverTra Ace－a－反转录试剂盒［东洋纺（上海）生物科技有限公司］说明书进行cDNA 的合成。反应条件的设置：37 ℃15min，98 ℃5min，反应结束后保存于－20 ℃待用。取逆转录产物连续10倍梯度稀释，然后以内参β－actin引物进行荧光定量PCR 反应。PCR 反应体系为20μl，根据表2配置。反应条件为95 ℃2min；95 ℃15 s，60 ℃40s，45个循环，60 ℃获取荧光信号；循环结束后从65 ℃升高到95 ℃获取溶解曲线。

1.3 统计学方法 实验结果均采用SPSS 13.0 统计软件进行方差分析。

表1 使用的引物

表2 20μl荧光定量PCR 反应体系

2 结果

2.1 DPOAE检测结果 4组小鼠80dB SPL刺激声下各频率的DPOAE幅值见表3，第1、2和3组小鼠3、4、6、8、10和12kHz DPOAE幅值均较正常对照组小鼠降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组、第1组、第2组和第3组小鼠DPOAE 幅值依次逐渐降低，在3、4、6、8、12kHz的差异有统计学意义（P＜0.05），在10kHz的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组小鼠不同频率DPOAE幅值比较（dB SPL，±s）

表3 各组小鼠不同频率DPOAE幅值比较（dB SPL，±s）

组别耳数（耳）频率（kHz）3 4 6 8 10 12正常对照组12 21.0±0.7 6.4±0.8 21.7±7.2 30.0±3.3 35.8±4.1 37.3±3.9第1组12 20.1±0.7 6.1±0.4 12.7±1.6 25.9±10.1 25.7±4.1 28.6±2.0第2组12 20.0±0.9 5.7±0.7 11.5±1.4 24.2±7.0 24.3±6.6 27.3±3.4第3组12－7.1±3.3－11.0±2.8 5.0±2.2 20.6±4.5 23.2±5.8 26.7±5.5 F 5.316 8.693 5.547 4.881 1.490 3.295 P 0.003 0.000 0.003 0.005 0.230 0.029

2.2 各组动物耳蜗组织Prestin蛋白表达 不同剂量放射线照射均抑制了Prestin蛋白的表达，与正常对照组比较，第1、2和3组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白的表达均明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着放射线剂量的增加，小鼠耳蜗组织Prestin蛋白的表达逐渐下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、2。

2.3 各组动物耳蜗组织Prestin mRNA 的相对表达 Prestin mRNA的相对表达量见图3，可见，与正常对照组相比较，不同剂量放射线照射后小鼠耳蜗组织Prestin mRNA 相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），随着放射线剂量的增加，正常对照组、第1、2和3组小鼠耳蜗组织Prestin mRNA 相对表达量依次逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 各组小鼠耳蜗组织Prestin的表达

图2 各组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白的相对表达量

图3 各组小鼠耳蜗组织Prestin mRNA 相对表达量

3 讨论

鼻咽癌（carcinoma of nasopharynx，NPC）是我国南方地区高发的恶性肿瘤之一，大部分为低分化鳞癌，放射治疗是鼻咽癌等头颈部恶性肿瘤的主要治疗手段。众所周知，放射治疗头颈部肿瘤常导致感音神经性听力损失，如：鼻咽癌患者在接受完整的放射治疗后很快就会出现感音神经性听力下降，尤其在高频最常见，并且这种听力损伤是不可逆的，这可能与放射线对耳蜗结构、功能的受损有关［13～15］。放射线导致的感音神经性听力损失的程度与耳蜗吸收的射线剂量的大小密切相关，对内耳放射剂量的限制可降低感音神经性听力损失程度及发生率［16，17］。小剂量放射线照射即可导致耳蜗组织结构的损伤，Kim 等［18］报道10～15Gy单一剂量放射线照射即可引起内耳毛细胞的明显损伤；范静平等［19］用20Gy60Co对豚鼠内耳进行照射，结果提示豚鼠内耳在小剂量放射线照射后受到了潜在的损伤。放疗引发的听力损伤早期诊断非常重要，目前多通过DPOAE监测耳蜗功能，其敏感性优于纯音测听，可早期判断是否有耳蜗功能的损伤。Akmansu等［20］以DPOAE为检查方法进行动物实验，发现放射线照射后1 周、8 周所有频率DPOAE 幅值均有下降趋势。从文中结果看，给予不同剂量的放射线照射后，3组照射组小鼠3、4、6、8、10和12kHz的DPOAE幅值均较正常对照组小鼠降低，随着放射线剂量的增加，各照射组小鼠的DPOAE 幅值依次逐渐降低。说明放射线照射导致了小鼠耳蜗功能的受损，与范静平等［21］研究发现放射线照射早期电镜下即可见豚鼠耳蜗基底回外毛细胞纤毛消失，大量外毛细胞坏死溶解的结果相符。由此可见，DPOAE检测可在一定条件下反映鼻咽癌患者放疗后外毛细胞受损状况，提示受损的基底膜节段，可以及早发现患者内耳功能的损伤，为临床防护及早期干预提供依据。

放射线照射后出现感音神经性听力损失的损伤机理尚未明确，目前主要有以下两种推测：其一是辐射直接作用于感觉细胞引起膜结构如细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜脂质过氧化作用及细胞核中DNA损伤，导致细胞代谢障碍，使毛细胞变性、坏死、功能异常。Kim 等［18］发现在一次较大剂量辐射后18h豚鼠耳蜗毛细胞即出现常染色质凝集、异染色质分散及线粒体多样改变、液泡形成；张孝文等［22］采用60Co照射豚鼠的耳颞区，然后对耳蜗毛细胞进行DNA 损伤检测，结果表明对照组与各照射组（剂量40Gy、70Gy）之间内毛细胞DNA 损伤差异有统计学意义，且随照射剂量增加DNA 损伤加重，故认为，放射治疗后内耳毛细胞DNA 损伤导致细胞凋亡是致聋的重要机制。其二是血管纹及其中微小血管的损伤，引起内耳微循环障碍。Kim 等［18］在电镜下观察到耳蜗血管纹形态的变化为胞内和血管旁液体聚集；杨新明等［23］发现40Gy的放射线照射24 h，豚鼠耳蜗血管纹的边缘细胞、中间细胞、毛细血管内皮细胞及周围间质轻度水肿，2周后病变加重，线粒体肿胀、变形，而螺旋器的病变相对较轻，推测血管纹比螺旋器对辐射更为敏感，辐射导致内耳损伤最早变化的是血管纹，认为辐射致内耳循环障碍是内耳损伤最主要的致病机理。马达蛋白Prestin对于哺乳动物听觉灵敏性和频率选择性的重要性已被诸多学者所证实［7～9］，本实验结果显示，给予不同剂量的放射线照射后，小鼠的听觉功能明显受损，且在放射线照射后第7天各组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA 的表达量较正常对照组小鼠下降，且随着放射线剂量的增加，其表达量依次逐渐下降，由此推测放射线照射后的听力损失可能还与放射线导致耳蜗外毛细胞Prestin蛋白功能表达下调有关。

有文献报道［24］：放射线照射导致的SNHL 主要表现为低、中、高频段全频率范围内不同程度的听力下降，Akmansu等［20］研究放疗总量55Gy 对大鼠的影响，行2～6kHz频率范围内的DPOAE 检测，发现在该频率范围内DPOAE 的幅值在放疗后第1～8周呈增加趋势。目前本次实验只是就不同剂量的放射线单次单侧照射对Balb／c小鼠畸变产物耳声发射（3～12kHz频率范围）和耳蜗外毛马达蛋白Prestin表达的影响及放射线照射导致感音神经性听力损失的可能机制作了初步的探讨，今后尚需要扩大DPOAE检测的频率范围，利用扫描电镜、耳蜗免疫组化等技术，结合耳蜗毛细胞的形态学、病理学观察，进行更深入、系统的临床及动物实验研究。

1 Lau SK，Wei WI，Sham JS，et al.Early changes of auditory brain stem evoked response after radiotherapy for nasopharyngeal carcinoma－－a prospective study［J］.J Laryngol Otol，1992，106：887.

2 Jereczek－Fossa BA，Zarowski A，Milani F，et al.Radiotherapy－induced ear toxicity［J］.Cancer Treat Rev，2003，29：417.

3 Low WK，Tan MG，Chua AW，et al.12th Yahya Cohen Memorial Lecture：The cellular and molecular basis of radiationinduced sensori－neural hearing loss［J］.Ann Acad Med Singapore，2009，38：91.

4 Zheng J，Shen W，He DZ，et al.Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells［J］.Nature，2000，405：149.

5 Schanzler M，Fahlke C.Anion transport by the cochlear motor protein prestin［J］.Physiol，2012，590：259.

6 Nilsen N，Brownell WE，Sun SX，et al.Effect of membrane mechanics on charge transfer by the membrane protein prestin［J］.Biomech Model Mechanobiol，2012，11：107.

7 Brownell WE，Spector AA，Raphael RM，et al.Micro－and nanomechanics of the cochlear outer hair cell［J］.Annu Rev Biomed Eng，2001，3：169.

8 Cheatham MA，Huynh KH，Gao J，et al.Cochlear function in Prestin knockout mice［J］.J Physiol，2004，560：821.

9 Oghalai JS.The cochlear amplifier：augmentation of the traveling wave within the inner ear［J］.Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2004，12：431.

10 Zheng J，Anderson CT，Miller KK，et al.Identifying components of the hair－cell interactome involved in cochlear amplification［J］.BMC Genomics，2009，10：127.

11 Wu X，Gao J，Guo Y，et al.Hearing threshold elevation precedes hair－cell loss in prestin knockout mice［J］.Brain Res Mol Brain Res，2004，126：30.

12 Liberman MC，Gao J，He DZ，et al.Prestin is required for electromotility of the outer hair cell and for the cochlear amplifier［J］.Nature，2002，419：300.

13 Soh JM，D＇Souza VD，Sarepaka GK，et al.Cochlear implant outcomes：a comparison between irradiated and non－irradiated Ears［J］.Clin Exp Otorhinolaryngol，2012，51：93.

14 郭运凯，杨新明，谢鼎华，等.鼻咽癌患者放疗后引起感音神经性聋的临床观察［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2005，40：805.

15 Upadhya IN，Jariwala N，Datar J.Ototoxic effects of irradiation［J］.Indian J Otolaryngol Head Neck Surg，2011，63：151.

16 Rasmussen R，Claesson M，Stangerup SE，et al.Fractionated stereotactic radiotherapy of vestibular schwannomas accelerates hearing loss［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，83：607.

17 Petsuksiri J，Sermsree A，Thephamongkhol K，et al.Sensorineural hearing loss after concurrent chemoradiotherapy in nasopharyngeal cancer patients［J］.Radiat Oncol，2011，6：19.

18 Kim CS，Shin SO.Ultrastructural changes in the cochlea of the guinea pig after fast neutron irradiation［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，1994，110：419.

19 范静平，陆书昌.γ射线与噪声对内耳损伤的实验研究［J］.中华耳鼻咽喉科杂志社，1992，27：153.

20 Akmansu H，Eryilmaz A，Korkmaz H，et al.Ultrastructural and electrophysiologic changes of rat cochlea after irradiation［J］.Laryngoscope，2004，114：1 276.

21 范静平，陆书昌，胡正元，等.急性放射性损伤豚鼠耳蜗扫描电镜观察［J］.第二军医大学学报，1992，13：47.

22 张孝文，张承发，张建平.头颈部60Co照射豚鼠耳蜗毛细胞DNA 损伤的检测［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33：45.

23 杨新明，卢永德，陈忠，等.电离辐射对内耳形态与功能影响的实验研究［J］.中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，1997，3：81.

24 陆雪官，刘志勇，张力元，等.鼻咽癌放射治疗后感音神经性耳聋的临床分析［J］.中华放射医学与防护杂志，2005，25：264.