多西紫杉醇对大肠癌细胞放射增敏的作用研究

赵维勇 刘志远 毕良文 张丽珍▲

1.南京医科大学第二附属医院放疗科，江苏南京 210011；2.南京市胸科医院放疗科，江苏南京 210011

在消化系统恶性肿瘤中，大肠癌最为常见。 大肠癌患者的发病率及死亡率每年均呈增长趋势，如今在我国，大肠癌已成为恶性肿瘤病死原因的第2 位。大肠癌确诊时大多已为晚期，术前放射治疗可以使肿瘤体积缩小，从而能降低直肠癌的临床分期及局部复发率，最终达到延长生存期的目的。 近年来，放疗联合化疗药物使直肠癌疗效提高，患者受益，因而在局部晚期直肠癌中，新辅助治疗多选择放化疗联合[1]。 多项研究已证实多西紫杉醇能提高非小细胞肺癌、宫颈癌、食管癌等细胞的放射敏感性[2-4]。本实验以多西紫衫醇联合放疗作用于大肠癌细胞，探讨多西紫衫醇对肠癌潜在可能的放射增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 人肠癌细胞株SW480 细胞购自上海生命科学研究院；多西紫杉醇（艾素）为江苏恒瑞医药股份有限公司生产；RMI-1640 购自GIBCO BRL 公司；AnnexinV-FITC/PI 检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2 主要仪器 生物倒置显微镜，CO2培养箱， 分光光度计，医科达医用直线加速器（瑞典），台式低速离心机，流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法观察多西紫杉醇对SW480 的增殖抑制作用 设对照组、空白组及多西紫杉醇作用组。SW480细胞培养到一定数量，96 孔细胞培养板中每孔约5×103个细胞。 加入不同浓度多西紫杉醇（0.1、0.5、1、3、5、10、20、40、60 μg/mL）培养液，每个浓度及组内设3 复孔。 继续培养24、48、72 h 后，将96 孔板进行MTT 染色，测定OD 值（λ=490 nm），计算抑制率。 抑制率（%）＝（1-实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。 以抑制率为纵轴，多西紫杉醇浓度为横轴，制作SW480 细胞生长抑制曲线图。 通过概率单位加权回归法（Bliss 法）计算IC50。

1.2.2 克隆形成法检测多西紫杉醇对直肠癌SW480细胞的放射增敏作用 完全培养液3 mL 于5%CO2，37℃培养箱中培养24 h，细胞贴壁后，进行分组处理：对照组；多西紫杉醇组：多西紫杉醇5 μg/mL（20% IC50）；放疗组：不同照射剂量（0、1、2、4、6、8 Gy） 照射；多西紫杉醇+放疗组：5 μg/mL 多西紫杉醇处理细胞后2 h，再分别进行不同剂量（0、1、2、4、6、8 Gy）照射。每个浓度及组内设3 复孔。 处理结束后继续培养48 h，然后弃去含药物的培养液， 换新鲜的不含药物的培养液，于培养箱内培养10～14 d。 当6 孔细胞培养板中出现肉眼可见的克隆的时候，经过洗涤、固定、染色，在低倍镜下计数大于50 个细胞的克隆数，计算相关指标。公式：贴壁率（plating efficiency，PE）=对照组每孔克隆数/每孔细胞种植数×100%； 存活率或存活分数（surviving fraction，SF）=实验组每孔克隆数/（每孔种植数×贴壁率）。以单击多靶数学模型拟合细胞存活曲线，计算出放疗组和放疗联合药物组的D0值， 放射增敏效应以放射增敏比（SERD0）表示，定义为单独放疗组与放疗联合药物组的D0之比。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期分布 分组： 对照组、放疗组、多西紫杉醇组和多西紫杉醇+放疗组。将细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁后，对照组更换无药培养液，多西紫杉醇组更换含有5 μg/mL 多西紫杉醇的培养液，放疗组给以4 Gy 剂量照射；多西紫杉醇+放疗组给予5 μg/mL 多西紫杉醇同时接受4 Gy 照射。组内设3 复孔。继续培养48 h，收集细胞，洗涤、固定、PI 染色后，记录激发波长488 nm 处红色荧光。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法检测细胞凋亡实验分四组：对照组、单纯照射组、多西紫杉醇组和多西紫杉醇+放疗组。待细胞贴壁后，加入相应的含药培养基及照射处理（同“1.2.3”项下），每个浓度及组内设3 复孔。 药物作用48 h 后， 收集细胞、 洗涤， 加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide， 采用流式细胞仪观察细胞凋亡的发生情况

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料数据用均数±标准差（s）表示，多组间比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多西紫杉醇对SW480 细胞增殖的影响

多西紫杉醇抑制SW480 细胞增殖作用与浓度呈正相关（F = 84.71，P ＜0.001）；与时间呈正相关（F = 26.30，P ＜0.001）。 见表1、图1。 后续研究选择多西紫杉醇5 μg/mL 作用48 h， 作为放射增敏浓度和时间。

表1 多西紫杉醇对人肠癌细胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

表1 多西紫杉醇对人肠癌细胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

0.1 0.5 1351 0 20 40 60 1.11±2.43 2.34±1.56 8.30±1.54 10.30±1.39 21.33±1.23 28.44±0.99 34.21±1.43 40.34±1.23 45.22±1.51 1.33±2.01 3.89±2.18 10.22±1.19 13.45±1.29 23.92±2.20 38.65±1.23 49.67±1.00 54.76±1.18 57.33±1.35 3.11±2.39 8.22±2.30 17.33±1.23 22.13±1.76 35.33±2.01 44.11±1.24 56.33±1.02 61.21±1.10 63.11±1.94

图1 多西紫杉醇对人肠腺癌细胞SW480 增殖的抑制作用

2.2 多西紫杉醇的放射增敏实验结果

由表2 可见，SF 及克隆形成随着照射剂量的升高而降低。 使用单击多靶模型对SF 和放射剂量进行曲线拟合，见图2。 根据拟合的细胞存活曲线及相关公式，得出相应参数D0、Dq、SER 值，多西紫杉醇+放射组的Dq、SF2值均低于单纯放疗组，见表3，提示多西紫杉醇可使SW480 细胞的放射敏感性明显增强，其SER 值为1.73。

2.3 多西紫杉醇影响SW480 细胞周期的分布

流式细胞仪结果显示， 多西紫杉醇作用后，SW480 细胞周期发生变化，G2/M 期细胞比例由（32.19±0.47）%增高到（46.24±0.07）%，多西紫杉醇+放疗组增高到（58.08±0.05）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表4、图3。

表2 多西紫杉醇、多西紫杉醇联合放射线的细胞存活分数

图2 根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线

表3 不同组别细胞存活曲线的主要参数

表4 多西紫杉醇联合或不联合放疗对人肠癌SW480 细胞周期的影响（%，s）

表4 多西紫杉醇联合或不联合放疗对人肠癌SW480 细胞周期的影响（%，s）

注：与对照组比较，#P < 0.05；与放疗组比较，*P < 0.05

对照组多西紫杉醇组放疗组多西紫杉醇+放疗组38.29±0.85 32.42±0.28 28.91±0.27 23.63±0.32 29.52±0.51 21.34±0.58 21.72±0.46 18.29±0.45 32.19±0.47 46.24±0.07#49.37±0.35#58.08±0.05#*

图3 多西紫杉醇联合或不联合放疗对人肠癌SW480 细胞周期的影响

2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法检测多西紫杉醇联合放疗对人肠癌细胞SW480 凋亡的影响

流式细胞仪检测各组细胞经不同处理后的细胞凋亡的改变，结果显示，多西紫杉醇可提高放疗诱导的凋亡（P < 0.05）。 见表5。

表5 多西紫杉醇不联合或联合放射线对人肠癌细胞SW480 凋亡的影响（%，s）

表5 多西紫杉醇不联合或联合放射线对人肠癌细胞SW480 凋亡的影响（%，s）

注：与对照组比较，#P < 0.05；与放疗组比较，*P < 0.05

对照组多西紫杉醇组放疗组多西紫杉醇+放疗组1.43±0.05 18.33±0.32#8.98±0.03#21.54±0.22#*

3 讨论

直肠癌常使用放疗作为局部治疗方法，在直肠癌的综合治疗中，放疗扮演着重要角色。但临床上，直肠癌患者对放射治疗的敏感性表现各异，可能是因为肿瘤细胞乏氧的程度有差异， 同时肿瘤本身存在异质性，并且直肠癌放疗可以引起消化道出血、疼痛、穿孔等放疗反应， 尤其是在超过正常组织耐受剂量情况下，反应更为强烈，患者难以耐受。高效低毒的放射增敏剂可提高直肠癌放疗效果， 提高患者生活质量，成为肿瘤放射治疗的研究热点[1]。

多西紫杉醇是一种半合成的紫杉醇类抗肿瘤新药，作用于细胞的微管系统，在肿瘤细胞有丝分裂时，能促进微管聚合，同时抑制微管解聚，使游离微管减少，影响细胞有丝分裂的进行，引起肿瘤细胞死亡。多项研究证实，多西紫杉醇对头颈部恶性肿瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等多种细胞株都有抑制增殖的作用，同时肿瘤细胞的凋亡增加。深入研究发现，多西紫杉醇可引起细胞bcl-2 基因磷酸化而失活，同时bax基因过度表达，从而诱导了肿瘤细胞凋亡增加[5-6]。 另外，大量的动物实验及临床研究证实，多西紫杉醇能提高宫颈癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等细胞的放射敏感性[2-3]。 本研究表明， 多西紫杉醇对大肠癌细胞系SW480 有类似作用， 多西紫杉醇对大肠癌细胞系SW480 的生长抑制作用有一定的剂量和时间依赖性；多西紫杉醇+放疗组的D0、Dq、SF2值均比单纯照射组低，5 μg/mL 多西紫杉醇SER 值为1.73；SW480 细胞经多西紫杉醇处理后对射线更敏感，细胞凋亡增加，多西紫杉醇+放疗组凋亡发生率为（21.54±0.22）%，明显高于单独放疗组。本研究显示多西紫杉醇对大肠癌细胞系SW480 有放射增敏作用， 说明多西紫杉醇对SW480 细胞是一种良好的放射增敏剂。

细胞对放射线的敏感性与所处的细胞周期时相相关，G2/M 期最敏感，S 期对放射抗拒[7]。 不同化疗药物作用机制和环节不同，大多可改变细胞周期。 有目的使用化疗药物，从而改变细胞周期，可增加放射敏感性，对肿瘤治疗有重要意义。有研究表明，多西紫杉醇具有放射增敏作用，表现为肿瘤细胞G2/M 期阻滞，同时乏氧细胞再氧合，从而对射线敏感性增加[2]。本研究发现，多西紫杉醇可以使SW480 细胞的G2/M 期比例升高（46.24±0.07）%比（32.19±0.47）%，多西紫杉醇+放疗组更高达（58.08±0.05）%，S 期比例降低。 提示多西紫杉醇使细胞周期重新分布， 各期比例变化，G2/M 期肠癌细胞比例增加， 放疗后细胞凋亡明显增加。

综上所述，本实验显示，多西紫杉醇对大肠癌细胞具放射增敏作用，其机制可能是改变了肠癌细胞的周期分布，诱导其凋亡增加。 本实验探索为直肠癌的治疗提供了新的手段和方法，但其分子机制及临床使用的时机、剂量和策略仍需进一步探索和深入研究。

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